氯化锂－紫外－微波复合诱变红霉素高产菌株的研究

王智慧， 杨 帅， 刘宏民

(郑州大学药学院 河南 郑州450001)

0 引言

红霉素(erythromycin)是红霉素链霉菌的次级代谢产物，为十四元大环内酯类抗生素．它的抗菌谱和青霉素相似，特别是对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性，是治疗溶血性链球菌和耐药性金黄色葡萄球菌感染所引起疾病的首选药物，同时红霉素类衍生物的生产应用进一步刺激了对母体红霉素的需求［1］．影响红霉素发酵的主要因素是菌种的质量，其优劣对红霉素发酵工业有极大的影响［2］．目前我国红霉素的发酵工业与国外相比还有较大的差距，作者拟通过对红霉素生产菌种的改良，通过氯化锂、紫外和微波的复合诱变，以达到提高红霉素发酵效价，降低红霉素生产成本，增强我国红霉素的国际市场竞争能力的目的．

1 材料与方法

1．1 菌种

红霉素生产菌株为红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)．

1．2 培养基

斜面、平板与茄子瓶培养基(g/L):玉米淀粉10，硫酸铵3，蛋白胨10，玉米浆12，氯化钠3，碳酸钙3，琼脂粉20～22;pH 7．0～7．2．摇瓶种子培养基(g/L):玉米淀粉25，黄豆饼粉18，玉米浆13，蛋白胨5，糊精25，葡萄糖10，氯化钠 4，碳酸钙8，硫酸镁0．25，磷酸二氢钾0．2，硫酸铵 12;豆油 0．4 mL/50 mL，pH 7．0 ～7．2．摇瓶发酵培养基(g/L):黄豆饼粉30，可溶性淀粉45，正丙醇10，糊精5，硫酸铵3，氯化钠3，碳酸钙4，葡萄糖10，硫酸镁 1．2，磷酸二氢钾 0．2;豆油 0．4 mL/50 mL，pH 6．8．

1．3 培养条件

斜面、平板与茄子瓶培养条件:培养温度34℃，相对湿度50%，培养时间8～9 d．摇瓶种子液培养条件:取两株经过活化的菌种，接入装有50 mL培养基的250 mL三角瓶内，培养温度32℃，相对湿度40% ～60%，摇床转速220 r/min，培养时间3～5 d．摇瓶发酵培养条件:摇瓶装量50 mL/250 mL，接种量10%，32℃培养，相对湿度40% ～60%，摇床转速220 r/min，培养时间6～7 d［3］．

1．4 诱变及筛选方法

1．4．1 单孢子悬液的制备 成熟的新鲜斜面加入10 mL无菌水，将培养好的新鲜斜面孢子刮洗下来装入带有玻璃珠的500 mL三角瓶内，220 r/min振摇20 min，过滤成菌悬液备用．

1．4．2 紫外诱变 将制备好的孢子悬液用生理盐水依次稀释，采用血细胞计数板计数，得到孢子数约在100～1 000个/mL的菌悬液．取10 mL菌悬液至9 cm培养皿中，在用磁力搅拌器搅拌的同时，于15 W紫外灯(λ =253．7 nm)，距离30 cm 条件下照射0，15，30，45，60 s．然后涂布于种子培养基上，放入34℃恒温培养箱培养2～3 d．

1．4．3 氯化锂诱变 用移液器吸取0．1 mL孢子悬液于氯化锂质量浓度依次为0，2，4，8，10 mg/L的梯度培养皿中进行涂布，放入34℃恒温培养箱培养2～3 d．

1．4．4 微波诱变 吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的培养皿中，每个培养皿的悬液量为10 mL，调微波炉功率为700 W，脉冲频率为2 450 MHz，处理时间分别为0，15，30，45，60 s．然后从每个培养皿中取出0．1 mL菌悬液，分别用0．85%生理盐水梯度稀释，稀释梯度为10－2～10－7，得到不同稀释梯度的菌悬液．取稀释后的菌悬液0．1 mL涂布于培养皿，放入34℃恒温培养箱培养2～3 d［4］．

1．4．5 氯化锂－紫外－微波复合诱变 将制得的孢子悬液先涂布于氯化锂平板培养基上，在紫外灯下照射一段时间后进行培养，然后将培养基放入微波炉选择合适时间进行诱变．从每个培养皿中取出0．1 mL菌悬液，分别用0．85%生理盐水稀释，稀释梯度为10－1～10－7，得到不同稀释浓度的菌悬液．吸取稀释后的菌悬液0．3 mL，涂布分离培养基平板，然后置于34℃恒温培养箱培养3 d，活菌计数，计算致死率．

1．4．6 效价测定 精确称取样品10～12 mg于表面皿中，加乙醇(10 mg加入1 mL乙醇)后，加水稀释为1 000 μg/mL 的红霉素标准液．吸取 0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 于分液漏斗中，加入 0．35%碳酸钾溶液稀释至20 mL，再加入醋酸丁酯20 mL，混匀1 min，静置分层．吸取上层液体10 mL于另一个干燥分液漏斗中，准确加入0．1 mol/L HCl 10 mL，震荡30 s，静置分层．取下层溶液5 mL于另一个试管中，加入8 mol/L硫酸溶液5 mL，摇匀，于50℃水浴30 min，然后取出冷却至室温，以蒸馏水为空白，使用721型分光光度计于483 nm波长处进行比色，可得化学效价=23 247A483+864．97．

1．4．7 筛选方法 从培养成熟的菌落中挑选正常型菌落接斜面，待生长成熟后按10%的接种量接入摇瓶进行培养，测定红霉素的产率及组分．

1．5 统计学分析

所有实验均重复3次，数据采用SPSS 20．0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用x±s表示，P＜0．05表示差异具有统计学意义．

2 实验结果

2．1 紫外诱变

从经紫外线照射的每个剂量的平板中各挑选20株红霉素菌种进行摇瓶实验，考察紫外线照射时间对红霉素菌种正突变率的影响．结果如图1所示，菌种的致死率随着紫外线照射时间的延长而增加，45 s时致死率已经达到90．2%，此时正突变率为30．5%．60 s时菌株的正突变率为30%，而且菌株基本已经全部死亡．因此本实验确定45 s为紫外线最佳照射时间．

2．2 氯化锂诱变

氯化锂处理后的红霉素链霉菌随着氯化锂质量浓度的升高，致死率逐渐变大，同时正突变率出现了先增后减的趋势(图2)．当氯化锂质量浓度达到4 mg/L时，链霉菌株的致死率是36．2%，此时正突变率最高，为15．2%．因此本实验确定4 mg/L为最佳氯化锂诱变剂量．

2．3 微波诱变

本实验所选用微波炉的最大功率为700 W，因此选用最大功率700 W进行诱变，实验中使用冰浴降温以消除由于微波所产生的热效应．由图3可知，微波照射的红霉素链霉菌随时间的延长，致死率逐渐上升，而且在几个实验组中菌株致死率都在75%以上．当微波照射时间选择30 s时菌株的正突变率最高，为14．3%．因此本实验确定30 s为最佳微波照射时间．

图1 紫外诱变Fig．1 UV mutagenesis

图2 氯化锂诱变Fig．2 LiCl mutagenesis

2．4 复合诱变

按照优化的实验条件，即氯化锂的质量浓度为4 mg/L，紫外诱变45 s，微波诱变30 s，选择在最优条件下复合诱变后的正突变菌株各100株进行摇瓶发酵，结果如表1所示．复合诱变的致死率最高，为(92．2 ±2．8)%，正突变率也为最高的(40．6 ±2．2)%．说明复合诱变效果比单一诱变要好．将复合诱变出来的菌株再进行多次复合诱变，最终筛选出红霉素高产菌株，命名为W-12．图4所示为诱变菌株在培养皿中生长的单菌落．

图3 微波诱变Fig．3 Microwave mutagenesis

2．5 红霉素高产菌株遗传稳定性实验

将初始菌株和高产菌株W-12斜面传代，各传代5次，每代3个平行样本，然后接入发酵培养基中，37℃震荡培养168 h．发酵完成后进行效价测定，取3个值的平均值考察突变菌株的遗传稳定性．结果表明，该菌株具有良好的传代稳定性，遗传稳定性数据见表2．由表2可知，红霉素链霉菌菌株经过紫外、氯化锂、微波复合诱变后，抗生素效价最高达6 432 μg/mL，比初始菌株效价提高了11%．

表1 各种诱变结果的比较Tab．1 Comparison of various mutagenesis results

图4 红霉素链霉菌高产菌株Fig．4 High-producing strain of Streptomyces erythreus

表2 红霉素链霉菌菌株遗传稳定性数据Tab．2 Genetic stability data of Streptomyces erythreus strains

3 讨论

在试验和生产中经常使用各种诱变方法对工程菌进行诱变以期获得高产菌株［5］．诱变分为物理诱变和化学诱变:物理诱变主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、激光、微波、离子束等;化学诱变包括烷化剂、天然碱基类似物、氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物和吖啶等嵌入染料［6］．红霉素的菌种诱变选育一般采用紫外线、激光、快中子、微波等物理手段和氯化锂、亚硝酸盐等化学诱变．但是抗生素产生菌经过相同诱变处理后，有可能导致突变位点饱和，影响诱变效果，给继续提高带来困难［7］．

紫外线诱变具有方法简单、效果显著的优点，在抗生素筛选和微生物发酵过程中应用广泛．已经有很多报道证明紫外线与其他诱变剂进行复合处理，可使紫外线的诱变效果得到提高［8－9］．氯化锂能够导致AT-GC碱基对的转换或导致碱基的缺失，经过前处理进入细胞内与DNA结合，吸收紫外的能量后能够增强紫外线的诱变效应，如文献［10］报道采用氯化锂的前处理效果比较好，文献［11］使用紫外线和氯化锂复合诱变手段选育出红霉素高产菌株．

作者使用紫外、氯化锂和微波3种诱变方法共同筛选红霉素链霉菌高产菌株，主要考虑到这几种实验方法在实验室容易操作，而且氯化锂进入细胞内通过对顺式作用元件作用于DNA，使之形成基因增强子，从而提高紫外和微波的诱变效应［12－13］．实验结果也证实复合诱变具有良好的效果，与出发菌株相比，正突变率达到了40．6%．筛选得到诱变菌株W-12，该菌株效价比初始菌株提高了11%．由于时间关系，尚未对该菌株进行发酵罐试验，但是为下一步摇瓶培养基的优化奠定了较好的基础．

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