缺血预适应对肢体缺血／再灌注后肺组织P选择素表达的影响*
2013-03-19高洪波张连元
高洪波，张连元
（1.包头医学院，内蒙古 包头014040；2.河北联合大学，唐山063000）
肢体缺血／再灌注（limbs ischemia／reperfusion，LI／R）不仅可以引起局部缺血组织的损伤，还可以导致远隔部位器官损伤，肺脏是容易受累器官之一，主要表现为急性肺损伤（acute lung injury，ALI）。缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）是一种内源性的保护机制，Harkin等［1］认为此主要与肢体缺血预处理抑制炎症反应有关，其确切机制尚无定论。P选择素（p-selectin，P-s）在中性粒细胞与内皮细胞相互作用的起始阶段介导中性粒细胞沿内皮滚动、粘附。本研究旨在观察IPC对大鼠LI／R后肺组织P-s表达的影响，进而探讨IPC的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及模型复制
健康雄性Wistar大鼠（200～250）g由郑州大学医学部实验动物中心提供，共24只。动物随机分为三组（n＝8）：对照（C）组、肢体缺血／再灌注（LI／R）组和缺血预适应（IPC）组。复制肢体缺血／再灌注损伤模型：乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢近端，阻断血流4 h后松解，松解前将大鼠称重后用20%乌拉坦（5ml／kg）腹腔麻醉。IPC组预先阻断双后肢血流5 min，然后恢复血流灌注5 min，反复4次，其余操作同LI／R组。C组橡皮带松弛环绕后肢不阻断血流。将各组大鼠于恢复双后肢血流灌注4 h经腹主动脉用注射器取血致死，同时剖胸取肺备测各项指标。
1.2 检测指标
1.2.1 肺呼吸功能的检测 取动脉血后立即用自动血气分析仪测定动脉血氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2）。
1.2.2 肺水肿指标的测定 肺系数（lung index，LI）测定：将肺于气管分叉上1 cm剪断，称量肺湿重，计算肺系数（肺重／体重）（g／kg）。肺湿干比（wet／dry，W／D）测定：取肺组织约300mg，用滤纸吸净表面血迹后称湿重，置于80℃烤箱烘干72 h后取出称干重，计算其比值。
1.2.3 MDA和MPO活性测定 采用试剂盒（南京建成生物制品公司）测定各组动物血浆丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及肺组织中 MDA含量和髓过氧化物酶（myeloperoxide，MPO）活性。
1.2.4 P-s的蛋白测定 采用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）的方法检测各组动物肺组织P-s的蛋白表达情况，结合计算机自动图像分析系统对其结果进行定量分析。
1.3 统计学处理方法
数据以均数±标准差（±s）表示，采用 SPSS 11.5软件处理实验数据，组间比较用One-Way ANOVA分析后，采用q检验。
2 结果
2.1 各组动物血气的变化
与 C组比较，LI／R组 PaO2降低 33.4% （P＜0.01，表1）。IPC组PaO2虽然也低于C组，但与 LI／R组比较升高23.0%（P＜0.01，表 1）。各组动物 PaCO2差异无显著性（P＞0.05，表 1）。
Tab.1 Results of blood／gas analysis of different groups（mmHg，±s，n＝8）
Tab.1 Results of blood／gas analysis of different groups（mmHg，±s，n＝8）
C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group
Group PaO2 PaCO 2 C 30.10±4.26 95.67±7.94 33.08±6.08 LI／R 63.67±3.61** 34.23±5.21 IPC 78.33±5.62**＃＃
2.2 各组动物LI、W／D和血浆MDA的变化
与C组比较，LI／R组大鼠LI、W／D和MDA均明显升高，分别升高 16.7%、23.9%和 69.7%（P＜0.01，表 2）。与 LI／R组相比，IPC组大鼠LI、W／D和MDA均明显降低，分别降低7.8%、10.3%和 23.4%（P＜0.01，表 2）。
2.3 各组动物肺组织MDA、MPO、P-s的变化
与C组比较，LI／R组大鼠肺组织MDA、MPO和P-s均有不同程度的升高，分别升高 63.4%、27.3%和 187.5%（P＜0.01，表3），P-s阳性信号主要表达于肺血管内皮细胞（图1）。IPC组与LI／R组比较各项指标均有不同程度的降低，分别降低 24.0%、7.3%和 34.8%（P＜0.01，表 3）。
Tab.2 Changes of LI、W／D and the values of plasma MDA of differentgroups（±s，n＝8）
Tab.2 Changes of LI、W／D and the values of plasma MDA of differentgroups（±s，n＝8）
C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning；LI：Lung index；W／D：Wet／dry；MDA：Malondialdehyde**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group
Group LI（g／kg） W／D MDA（nmol／ml ）C 4.79±0.33 4.14±0.23 2.94±0.20 LI／R 5.59±0.14**5.13±0.27**4.99±0.37**IPC 5.15±0.17**＃＃4.60±0.11**＃＃3.82±0.40**＃＃
Tab.3 Values of MDA、MPO and P-s in lung tissue of different groups（±s，n＝8）
Tab.3 Values of MDA、MPO and P-s in lung tissue of different groups（±s，n＝8）
C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning；MDA：Malondialdehyde；MPO：Myeloperoxide；P-s：P-selectin**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group
Group MDA（nmol／mg pro）MPO（U／g）P-s（AOD）C 1.12±0.13 1.83±0.11 0.056±0.005 LI／R 1.83±0.39**2.33±0.16**0.161±0.007**IPC 1.39±0.10＃＃ 2.16±0.14**0.105±0.007**＃＃
Fig.1 Immunohistochemical staining with anti-p-selectin of lung tissue（IHC×100）
3 讨论
肢体缺血／再灌注损伤是临床上较常见的病理过程。研究表明，肢体缺血／再灌注后不仅加重局部组织的损伤，而且易引起其它远隔器官的继发性损伤，如急性肺损伤是最常见的继发性器官损伤。目前，关于LI／R导致远隔器官损伤的机制主要集中在自由基的产生及其所造成的氧化损伤和全身炎症反应的失控。肢体缺血时中性白细胞被激活，当缺血肢体再灌注时引发白细胞“呼吸爆发”，产生并释放大量自由基和颗粒物质，加重脂质过氧化反应，颗粒内的蛋白酶消化和分解弹性蛋白及胶原蛋白，造成组织损伤和血管通透性增加。本研究发现LI／R组肺组织MDA含量和MPO活性显著升高，说明多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）在肺内大量聚集。从而导致组织损伤和血管通透性增加，表现为肺系数和湿干比明显升高和PaO2明显降低，肺组织损伤加重。
LI／R造成远隔器官组织白细胞聚集过程中粘附分子起着重要作用，而P-s是粘附分子选择素家族的一个重要成员，通常储存于内皮细胞的分泌颗粒（Weibel-Palade小体）和血小板的α颗粒中。当内皮细胞和血小板经刺激活化后，迅速表达于细胞表面，它在介导白细胞与血管壁接触发挥重要的作用。研究表明［2］当组织发生炎症或遭遇其他损伤时，受炎症因子的刺激及细胞因子如肿瘤坏死因子-α等的诱导，Weibel-Palade小体和血小板α颗粒迅速与质膜融合从而使P-s在内皮细胞和血小板表达。Kiefmann R等［3］人通过建立内毒素兔肺微循环损伤模型，用免疫组织化学法和Western blot分析检测出肺组织的P-s表达上调，说明P-s参与ALI。本研究发现LI／R后4 h肺组织的P-s表达增加，可能造成PMN在肺血管的黏附、聚集、激活，进而加重脂质过氧化反应过程。
近年的研究发现多次短暂IPC可以增强细胞对缺血的耐受性，是调动机体内源性保护机制的有效措施［4］。局部IPC对远隔脏器的保护效应目前处于探索阶段，这种保护作用据称与IPC的延迟保护作用有关，已有实验揭示和神经-体液机制有很大关系［5］。本研究发现IPC可以减少肺组织P-s蛋白的表达，进而减少自由基和脂质过氧化损伤。各种损伤的指标明显降低，肺功能明显改善，损伤减轻。提示预适应对LIR后ALI具有保护作用。其具体机制有待于进一步探讨。
【参考文献】
［1］ Harkin DW，Barros D’Sa A A，McCallion K，etal.Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects againstacute lung injury［J］.JVascSurg，2002，35（6）：1264-1273.
［2］ Huang J，Upadhyay UM，Tamargo R J，etal.Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia［J］.SurgNeurol，2006，66（3）：232-245.
［3］ Kiefmann R，Heckel K，Schenkat S，etal.Platelet-endothelial cell interaction in pulmonarymicro-circulation：the role of PARS［J］.ThrombHaemost，2004，91（4）：761-770.
［4］ Kloner R A，Jennings R B.Consequences of brief ischemia：stunning preconditioning，and their clinical implications：part l［J］.Circulation，2001，104（24）：2981-2989.
［5］ 杨秀红，张连元，孙树勋.一氧化氮与肢体缺血再灌注后肺损伤［J］.国外医学：呼吸系统分册，2002，22（2）：60-62.
