TLR2／4在Hsp72调控类风湿关节炎滑膜细胞IL-10生成中的作用*

罗心静，莫选荣，周玲玲

（台州学院医学院生理学教研室，浙江台州318000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以周围关节滑膜组织炎症及骨质破坏为主要病理特征的系统性自身免疫病。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）72是哺乳动物细胞内含量最丰富的一种应激蛋白，其基本功能起到“分子伴侣”作用。研究表明，Hsp72能主动或被动释放到细胞外，并且与免疫细胞表面 TLR2／4受体（toll-like receptor 2／4）结合，参与对机体免疫功能的调节［1］。为了探讨细胞外Hsp72在RA滑膜炎症的作用及机制，本研究采用重组的Hsp72处理滑膜细胞，观察Hsp72对促炎细胞因子IL-10表达的影响，并且用TLR2或TLR4蛋白的单克隆抗体封闭TLR2或TLR4受体，观察TLR2或TLR4受体在Hsp72调控 IL-10表达中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Hsp72重组蛋白购自加拿大Stressgen公司；IL-10 ELISA试剂盒购自美国 RD公司；多粘菌素 B（PMB）、卵清蛋白（OVA）购自美国 Sigma公司；TLR2、TLR4小鼠单克隆抗体购自美国eBioscience公司；GAPDH小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；PCR酶购自日本Takara公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司。

1.2 滑膜细胞的分离和培养

滑膜组织标本来自关节置换术中所取下的新鲜RA患者滑膜组织，滑膜细胞的分离和培养方法见参考文献［2］。

1.3 IL-10水平检测

滑膜细胞经相应处理后，收集细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清中IL-10的水平。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 RT-PCR分析

用Trizol试剂提取细胞的总RNA，紫外分光光度计测量A260nm／A280nm比值。用鸟类成髓细胞瘤病毒 （AMV）逆转录酶合成第一链；用1μl的反转录产物作为模板，引物如下：TLR2 sense：5＇-GCCAAAGTCTTGATTGATTGG-3＇，TLR2 antisense：5＇-TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG-3＇； TLR4 sense：5＇-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3＇，TLR4 antisense：5＇-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3＇；GAPDH sense：5＇-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3＇，GAPDH antisense：5＇-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3＇。

TLR2和TLR4按如下的反应条件进行PCR扩增：95℃变性30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，扩增 35个循环；GAPDH的PCR扩增反应条件：95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增22个循环。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 Western blot分析

滑膜细胞培养一定时间后，倒掉细胞培养液，用PBS洗涤后，加入2×SDS裂解液裂解细胞，然后离心并收集上清，用Bradford法测定总蛋白浓度。将上清与6×SDS加样缓冲液（187.5 mmol／L Tris-HCl pH 6.8，6%SDS，30%甘油，150 mmol／LDTT，0.1%溴酚蓝）混合，煮沸 10 min，经 10%SDSPAGE凝胶电泳分离后，电转移法转移到PVDF膜上。室温下封闭4 h后，分别加入TLR2、TLR4或GAPDH等单克隆一抗，4℃过夜。洗去游离一抗后，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，反应2 h。洗去游离二抗后，用DAB显色。

1.6 统计分析

采用SPSS 13.0软件包处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较应用单因素方差（One-Way ANOVA）分析。

2 结果

2.1 滑膜细胞中TLR2或TLR4表达的检测

RT-PCR结果（图1A）表明，RA滑膜细胞中均存在TLR2和 TLR4mRNA的表达，TNF-α（5～20 ng／ml）刺激 6 h后 TLR2和TLR4mRNA表达明显增加；Western blot（图1B）结果也表明，RA滑膜细胞均存在 TLR2和 TLR4蛋白的表达，TNF-α（5～20 ng／ml）刺激12 h后TLR2和TLR4蛋白表达明显增加。

2.2 TLR2或 TLR4受体封闭对Hsp72所诱导的IL-10分泌的影响

ELISA结果显示，重组Hsp72刺激RA滑膜细胞24 h后能够显著诱导滑膜细胞分泌IL-10；煮沸预处理能消除Hsp72对IL-10分泌的促进作用，而PMB预处理却不能消除Hsp72对IL-10分泌的影响。此外，抗TLR4单克隆抗体预处理滑膜细胞30 min后，Hsp72所诱导IL-10的分泌显著降低，而抗TLR2单克隆抗体或无关抗体（IgG）预处理滑膜细胞，对IL-10的分泌无明显影响（表1）。

Fig.1 Expression of TLR2／4 in RA synoviocytes

Tab.1 Secretion of IL-10 in RA synoviocytes in each group detected by ELISA（pg／ml，±s，n＝6）

Tab.1 Secretion of IL-10 in RA synoviocytes in each group detected by ELISA（pg／ml，±s，n＝6）

Hsp72：Heat shock protein 72；PMB：Polymyxin B；TLR：Toll-like receptor；IL-10：Interleukin-10*P＜0.05 vs control； ＃P＜0.05 vs Hsp72 group

G r o u p I L-1 0 C o n t r o l 8 0.8±1 4.4 H s p 7 2 2 1 0.5±3 2.4*H s p 7 2＋b o i l i n g 2 0 8.5±3 1.3＃H s p 7 2＋P M B 8 3.6±1 5.9 T L R 2 a n t i b o d y＋H s p 7 2 2 0 3.8±3 4.4 T L R 4 a n t i b o d y＋H s p 7 2 1 0 5.2±1 6.5＃I g G＋H s p 7 2 2 0 8.0±3 5.6

3 讨论

正常情况下，促炎细胞因子和抗炎细胞因子保持动态平衡是维持机体免疫功能正常的必要条件。但是当促炎细胞因子产生过高，或抗炎细胞因子产生相对过低，这种平衡就被打破，机体免疫功能就会出现异常，从而导致RA等自身免疫性疾病的发生。大量证据表明，在RA的滑膜及滑膜液中，存在多种促炎细胞因子的显著增高，主要包括TNF-α、IL-6等，这些促炎细胞因子的显著升高是RA发生发展的重要因素。而IL-10是重要的抗炎细胞因子。IL-10能抑制促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-γ的生成，用 IL-10处理关节炎动物模型能明显延缓滑膜炎症的进展［3］。因此，抑制促炎细胞因子的产生或促进抗炎细胞因子的产生是治疗RA的有效策略。

细胞外Hsp72的功能目前尚不十分清楚，但是已有的研究表明细胞外Hsp72参与机体固有免疫和适应性免疫反应的调节，与自身免疫性疾病的发生、发展和预后有关。重组Hsp72能够刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及淋巴细胞产生多种细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1等，具有促炎功能和细胞因子样作用［4］。重组Hsp72也能诱导抗炎细胞因子（如IL-10）生成，发挥抗炎效应。

虽然有学者研究证实RA患者关节滑膜液和血液中Hsp72表达水平明显升高［2］，但细胞外Hsp72在RA炎症中的作用目前尚不清楚。为了进一步明确Hsp72的抗炎作用，本研究观察了Hsp72对滑膜细胞抗炎细胞因子IL-10表达的影响。结果表明，Hsp72能直接诱导滑膜成细胞分泌IL-10。为了排除重组Hsp72中微量LPS污染可能对细胞因子分泌的影响，本研究用PMB（能灭活LPS，对蛋白质活性没影响）或煮沸（能使蛋白失活，对 LPS活性没影响）两种方法预处理Hsp72，结果发现煮沸能消除Hsp72对 IL-10分泌的影响，而PMB对Hsp72作用没有影响。这些研究表明重组人Hsp72对RA滑膜细胞IL-10分泌的影响是Hsp72本身的特性而与LPS污染无关。

近年来研究表明，TLR2和TLR4参与固有免疫细胞对细胞外Hsp72的识别［5］。国外有学者利用流式细胞术发现滑膜细胞膜表面上有TLR2和TLR4受体的高表达。本研究从mRNA和蛋白质水平上进一步证实TLR2和TLR4在RA滑膜细胞中的表达，并且滑膜细胞受炎症因子刺激后TLR2和TLR4的表达水平升高，表明TLR2／4可能与RA炎症调节有关。为了证明TLR2或TLR4是否参与Hsp72对滑膜细胞功能调节，本研究使用抗TLR2或抗TLR4抗体分别封闭滑膜细胞表面的TLR2或TLR4受体。正如我们结果显示，抗TLR4抗体预处理滑膜细胞，消除了Hsp72对IL-10生成的影响，而抗TLR2抗体预处理细胞对IL-10生成无明显影响，这表明Hsp72对滑膜细胞IL-10分泌的影响是TLR4依赖性的，以上研究提示，细胞外Hsp72可能通过与TLR4结合调节滑膜细胞的功能。

【参考文献】

［1］ Asea A.Heat shock proteins and toll-like receptors［J］.HandbExpPharmacol，2008，（183）：111-127.

［2］ Nguyen T T，Gehrmann M，Zlacka D，etal.Heat shock protein 70 membrane expression on fibroblast-like synovial cells derived from synovial tissue of patients with rheumatoid and juvenile idiopathic arthritis［J］.ScandJRheumatol，2006，35（6）：447-453.

［3］ Isomaki P，Luukkainen R，Saario R，etal.Interleukin-10 functions as an antiinflammatory cytokine in rheumatoid synovium［J］.ArthritisRheum，1996，39（3）：386-395.

［4］ Quintana F J，Cohen IR.Heatshock proteins as endogenous adjuvants in sterile and septic inflammation［J］.JImmunol，2005，175（5）：2777-82.

［5］ Medzhitov R.Toll-like receptors and innate immunity［J］.NatRevImmunol，2001，1（2）：135-145.