运动对动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞AMPK激活的研究*

周 亮，吴 佳，刘 刚，杨则宜

（1.湖南科技大学体育学院，湘潭411201；2.国家体育总局运动营养研究所，北京100029）

运动改善心血管健康的机制在于运动增加机体血流速度，升高血管内皮的剪切应力，并上调一氧化氮（nitric oxide，NO）释放，但是其机制和信号通路尚不明确［1］。AMP激活蛋白激酶（5-AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种运动敏感分子，最新研究成果表明［2］，AMPK可能激活 eNOS在 Ser1179位的磷酸化、并促进NOS与Hsp90的结合而提高其活性，增加血管内皮细胞的NO释放量，提示AMPK可能是运动改善血管内皮功能的重要信号分子，但是尚未见运动对血管内皮的AMPK激活的研究报道。

1 材料与方法

1.1 实验对象

6～8周龄Wistar（购于中南大学医学部实验动物学部），雄性，饲以含脂肪21%、胆固醇0.15%的“西方类型膳食”饲料，经过动物模型检验，确定动脉粥样硬化形成后，随机分组。室温20～24℃，自然光照，自由饮食、饮水，分笼饲养，每笼5只，适应性饲养1周后用于正式实验。

1.2 动物分组

于动物模型建立实验前，随机选取12只为C组（正常对照组），未进行动物建模。42只大鼠用于AS建模，其中6只在建模开始6周后用于模型检验，其余建模成功大鼠随机分为3组，AS组（动脉粥样硬化模型组）、ASL组（动脉粥样硬化＋低强度有氧运动）、ASH组（动脉粥样硬化＋高强度有氧运动），每组各12只。

1.3 动物模型的建立

42只大鼠进行动物建模，依照温进坤等研究［3］，给予 AS、ASL和 ASH组高脂饲料，高脂饲料配方：大鼠标准饲料中加1%胆固醇，0.35%胆酸钠，5%猪油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前 3 d按 7×105IU／kg的总剂量分3次灌胃给予维生素D3。动物建模时间为6周，6周后进行动物模型检验。

1.4 有氧训练安排

据Fernando等的研究［4］，参考已有的文献中有关大鼠的运动量范围，各组大鼠适应性运动3 d，开始正式运动干预；起始强度10m／min，小强度每周递增1m／min，直至设定的运动组靶强度为13 m／min，0°坡度；大强度运动组每周递增2 m／min至靶强度22m／min，每周递增 1°坡度，直至靶坡度 8°。运动干预持续14周，每周5次，每次60min。

1.5 实验方法

1.5.1 动物模型检验 建模6周后随机抽取6只建模大鼠和2只正常对照大鼠处死，取胸主动脉上段5mm放入3%戊二醛固定液中前固定、磷酸盐缓冲液漂洗、1%锇酸后固定、脱水、浸透、包埋、切片、电子染色后观察。

1.5.2 血清取材检测 建模结束后各运动组大鼠进行运动训练6周，对照组保持正常饮食，禁食1 d，用戊巴比妥钠腹腔麻醉、宰杀，腹主动脉取血。血液提取后静置 30min，3 000 r／min离心 10min，分离血清。采用放射免疫法测定炎性因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），ELISA法测定 C-反应蛋白（C-reaction protein，CRP），按试剂盒步骤操作。

1.5.3 血管内皮细胞收集 氯胺酮麻醉，入腹后自左侧髂总动脉向心侧插入大隐静脉导管，注射肝素50 U，从髂总血管根部向上游离腹主动脉至主动脉弓下方，结扎切断各分支；剪开右髂总动脉根部灌洗至流出液清亮后，于髂总动脉根部、主动脉弓下方结扎切断，放于4℃含肝素抗生素盐水（肝素105 U／L，青霉素4×1013U／L）内运至细胞培养室；在750ml／L乙醇内浸泡5min后移入超净台，剪去血管两端，以4℃含肝素抗生素盐水冲洗管腔和外膜后，注入37℃预热的10 g／L胶原酶至另一端处可见灌入液为止，以无创血管夹夹闭两端，置于37℃无菌肝素抗生素盐水内；5 min后剪去一端收集消化液，并以Hanks液冲洗，加入离心管，以1 000 r／min离心 5 min，收集细胞。

1.5.4 Western blot印迹法 大鼠内皮细胞收集蛋白量不够，合并同组的3只大鼠内皮细胞，进行AMPK的蛋白质分析。处理后的各组细胞用预冷的PBS冲洗2次，加入细胞裂解液5 min，于12 000 r／min，低温离心15 min，BCA法检测总蛋白量，每样品取20μg上样，SDS-PAGE电泳。转膜，100 V恒压维持通电80 min。TBS漂洗。室温封闭1 h。加一抗（1∶1 000稀释），4℃过夜孵育。HRP标记的特异性二抗（1∶2 000）及 HRP标记的抗生物素抗体（1∶1 000）室温下孵育1 h。显影、定影、洗片。结果用凝胶成像软件定量扫描条带灰度，以目标蛋白条带／β-actin蛋白条带值为磷酸化水平。

1.6 统计学分析

所有数据用平均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件，两组间差异比较采用t检验。

2 结果

2.1 动物模型检验

对照组动脉各层结构完整，无钙化及脂肪沉淀。各造模组大鼠主动脉切片可见内膜细胞增生及内皮下出现淡染的空泡等动脉粥样硬化的早期病变，有些部位可见中膜平滑肌细胞增生、排列紊乱或隆起呈斑块状结构，有些部位中膜有明显的钙化形成，说明造模成功（图1）。

Fig.1 Transmission electron micrographs（3，500×）comparing control（A）and atherosclerotic（B）vessels

2.2 血清 IL-6、TNF-α、CRP分析

实验动物在动脉粥样硬化造模后的血管炎性因子浓度明显上升。AS模型组的IL-6水平相对对照组有升高，但是没有统计学意义，ASH组血清IL-6水平明显升高，相对与AS组和对照组均有统计学显著意义；ASH和ASL组的血清TNF-α浓度均显著低于AS组，但是ASL组的TNF-α浓度依然显著高于C组；AS造模后血清的CRP水平明显升高，运动组（包括ASL和ASH）虽然稍有降低但是没有统计学意义，造模后各组的CRP浓度均显著高于C组（表1）。

Tab.1 Change ofplasma IL-6 and TNF-αand CRP concentrations（±s，n＝12）

Tab.1 Change ofplasma IL-6 and TNF-αand CRP concentrations（±s，n＝12）

TNF-α：Tumor necrosis factor-α；CRP：C-reaction protein；AS：Atheroscleroticmodelgroup；ASL：Low intensity exercisemodel group；ASH：High intensity exercisemodel group*P＜0.05 vs control；＃P＜0.05 vs ASgroup

Group IL-6（pg／ml） TNF-α（ng／ml） CRP（μg／ml ）Control 98.54±23.85 0.78±0.14 1.86±0.35 AS 106.74±30.85 1.39±0.26* 3.92±0.79*ASL 112.36±27.96 1.14±0.23*＃ 3.25±0.76*ASH 136.57±32.74*＃1.09±0.27＃ 3.46±0.89*

2.3 内皮细胞AMPK蛋白表达分析

表2的实验结果显示，动脉粥样硬化模型组的AMPK蛋白量降低，但是与对照组相比没有统计学意义。运动可以上调血管内皮细胞的AMPK蛋白表达，ASL和ASH组与对照组或模型组相比均有统计学差异。动脉粥样硬化模型组的AMPK磷酸化低于对照组，但是没有统计学意义，运动诱导血管内皮细胞的AMPK磷酸化，ASL和ASH组的p-AMPK蛋白量均显著高于对照组或模型组，均有统计学差异。

3 讨论

血清炎性因子在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起着重要作用。1995年，Ross提出AS是以炎症反映为主要特征的一种疾病［5］，主要表现为动脉内皮细胞和平滑肌细胞在受到损伤后的一种炎性纤维组织增生。C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是机体在炎症、感染和组织损伤后产生的一种急性期反应蛋白，是机体非特异性炎症反应的敏感标志物之一。本实验研究发现，AS模型组的血清CRP浓度明显高于对照组（3.92±0.79vs1.86±0.35），这与大多数的研究结果是一致的。运动虽然有降低血清CRP的趋势，但是与模型组相比没有统计学意义。白介素-6（IL-6）是机体一种主要的抗炎症因子，大量文献报道运动诱导机体血清的IL-6浓度显著升高。本研究中大强度运动组的血清IL-6明显升高，这与其他人的研究结果基本一致，但是小强度运动组的IL-6水平在运动后没有显著意义的增加，这可能是由于长期运动锻炼导致的适应性变化或运动强度较低所致。肿瘤坏死因子（TNF-α）可能通过损伤内皮细胞、促进凝血、抑制纤溶、促进单核细胞对内皮细胞的粘附等作用，参与AS及冠心病的发生和发展过程。本研究中，AS组的TNF-α水平明显高于对照组，运动有效降低血清的 TNF-α水平，与AS组相比有统计学显著意义。

Tab.2 Changes of total AMPK and p-AMPK Thr172 in vascular endothelial cell（±s，n＝4）

Tab.2 Changes of total AMPK and p-AMPK Thr172 in vascular endothelial cell（±s，n＝4）

AMPK：AMP activated protein kinase；AS：Atherosclerotic model group；ASL：Low intensity exercise model group；ASH：High intensity exercisemodel group*P＜0.05 vs control；＃P＜0.05 vs ASgroup

Group P-AMPK Thr172 Total AMPK Control 1.00±0.32 3.21±0.98 AS 0.87±0.21 2.71±0.68 ASL 1.32±0.68＃ 5.46±1.65*＃ASH 1.56±0.41*＃ 4.68±1.54*＃

Fig.2 Comparison between the relative protein content（%）of AMPK and its phosphorylated in vascular endothelial cells C：Control group；AS：Atherosclerotic model group；ASL：Low intensity exercisemodel group；ASH：High intensity exercisemodel group

AMPK是一种多功能的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，由α、β和γ3个亚单位组成。研究显示，AMPK失活引起血脂代谢障碍、主动脉损伤是糖尿病和动脉粥样硬化的重要发病机理［6］。Goirand F等［7］利用AICAR激活血管内皮细胞AMPK蛋白，引起血管舒张，表明AMPK确实具有调节血管内皮依赖性舒张功能的生理学作用。国外有研究表明［8，9］，运动能刺激血管内皮细胞AMP激活蛋白激酶（5-AMP-activated protein kinase，AMPK）的磷酸化激活。血管内皮细胞AMPK激活能产生多种有益效应，其主要作用机制包括［3］：（1）促进内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的 S1177磷酸化，上调 NO释放量，改善血管内皮依赖性舒张功能；（2）对抗O2-、H2O2及 ONOO-等活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）的致细胞损伤作用，保护血管内皮；（3）通过磷酸化作用抑制乙酰辅酶A羧化酶活性，降低丙二酰辅酶A的合成，促进自由脂肪酸氧化，消减细胞脂毒性；（4）抑制核因子-κB（nuclear factorkappaB，NF-κB）活性，下调单核细胞趋化蛋白-1和细胞间黏附分子-1的表达，发挥抗炎作用。本研究发现，AS模型组的AMPK蛋白量及其磷酸化均较对照组低，但是没有统计学意义。而运动（包括大强度和小强度运动）显著的上调血管内皮细胞的AMPK蛋白表达，相对对照组及AS组均有统计学差异。低强度运动诱导血管内皮细胞的p-AMPK上调，相对AS组有显著升高，但是相对对照组没有统计学意义，而大强度运动组则相对AS组和对照组均显著上升。本研究的结果显示，运动可以上调血管内皮细胞的AMPK蛋白表达及其磷酸化，可能是运动改善心血管健康，防治动脉粥样硬化等心血管疾病的重要机制。

【参考文献】

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［3］ 温进坤，韩 梅，杜玮南，等.一种快速建立大鼠动脉粥样硬化模型的实验方法［J］.中国老年学杂志，2001，1（21）：50-52.

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［5］ Ross R.Cellbiology ofatherosclerosis［J］.AnnRevPhysiol，1995，57：791-804.

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［7］ Goirand F，Solar M，Athea Y，etal.Activation of AMP kinase alpha1 subunit inducesaortic vasorelaxation inmice［J］.JPhysiol，2007，581（Pt3）：1163-1171.

［8］ Zhang Q J，McMillin S L，Tanner JM，etal.Endothelial nitric oxide synthase phosphorylation in treadmill-running mice：role of vascular signalling kinases［J］.JPhysiol，2009，587（pt15）：3911-3920.

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