小剂量过氧化氢预处理对大鼠心肌缺血／再灌注损伤的保护作用*

冯润荷，张金财，李小倩，孙海丽，刘 斌，赵蕴珍，唐向东，李 静△

（1.天津医学高等专科学校，天津300222；2.南开大学医学院，天津300071）

急性心肌梗死是发达国家包括我国在内的头号杀手，在急性期导致猝死，在慢性期导致心力衰竭。虽然早期冠状动脉内支架置入恢复血液循环能大大改善患者的预后，但再灌注损伤（reperfusion injury，RI）导致的心律失常与心功能损害仍缺乏满意的防治措施。众多资料表明，心肌缺血之前若给予短暂多次缺血处理，可以明显减轻接下来的长期缺血／再灌注损伤，此即著名的缺血预适应现象（ischemic preconditioning，IPC）。近来还发现，IPC可以在缺血后诱导（缺血后适应），甚至在心脏以外器官如下肢来远程诱导（远程预适应）［1］。深入研究IPC的发生机制有助于设计新奇的心肌保护（cardioprotection）措施，切实降低急性心肌梗死的死亡率。

然而，关于缺血预适应的心脏保护机制的认识仍然很模糊，其中，预缺血期间产生小剂量过氧化氢被推测是IPC的一个关键步骤［2］。最近研究表明，小剂量过氧化氢预处理的确能够减轻线粒体钙超载（Ca2＋overload），减少线粒体内膜通透转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放，改善心功能［3］，但对相关机制争论颇多。在本实验中，我们首先证实，小剂量过氧化氢能够有效保护再灌注导致的心功能损害；然后证明短暂缺氧导致过氧化氢生成；最后证明小剂量过氧化氢能够预防线粒体细胞色素c释放。这些崭新的结果为进一步发现干预心肌再灌注损伤措施提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

鱼藤酮（rotenone）、H2O2与 Anti-Cyt c购自 Sigma-Aldrich，H2-DCFDA为 Invetrogen产品。

1.2 细胞培养、缺氧模型建立与H2O2荧光观察

H9c2大鼠心肌细胞系的分离培养参照本实验室建立的常规方法［4］。H9c2传代，铺12孔板，细胞密度约80%。模拟缺血／缺氧用鱼藤酮（5μmol／L）处理30 min，将药物洗去后即导致再灌注损伤［5］。细胞内H2O2产生量用荧光染料H2-DCFDA观察。

1.3 实验动物与分组

SD大鼠40只，雄性，体重（250±30）g，12周龄左右，购自军事医学科学院动物实验中心。大鼠随机分为假手术组（Sham）、缺血／再灌注组（I／R）、缺血预适应组（IPC）和小剂量过氧化氢预处理组（H2O2）。

1.4 Langendorff实验

Langendorff灌流基本步骤按实验室常规进行［4］。大鼠经水合氯醛麻醉后开胸取心脏，并快速将心脏置于Langendorff装置。稳定灌流20min后停灌30min，然后复灌2 h，此即经典缺血／再灌注模型（I／R）建立（图 1）。IPC是在缺血前给予 3个缺血（5 min）-再灌注（5 min）循环，H2O2的给药时间点与此相同。左心室发展压（left ventricular develop pressure，LVDP）与左室内压上升最大速率（maximum rate of left ventricular pressure rise，dp／dtmax）持续记录，比较的时间点为再灌注后0.5 h与1 h。

Fig.1 Experimental design and representative cardiac pressure recording tracing

1.5 LDH活性测量

在复灌1 h收集流出液，-20℃保存待集中测量。LDH活性用试剂盒测定。

1.6 线粒体分离与mPTP诱导

先将Mito I分离液放入-20℃冷冻（30 min）成冰渣。麻醉 SD大鼠，取适量新鲜肝脏，立即在上述Mito I中，剪成1 cm3的小块。称取适量肝脏组织（约 0.142 g制成 2.4ml线粒体悬液），剪碎，研磨器中研磨至成为无组织块存在的浑浊液体。离心10 min（4℃，600×g）后弃沉淀，将上清再离心 10 min（4℃，12 000×g），弃上清，沉淀即为线粒体，再用适量线粒体悬浮液重悬线粒体（约0.142 g肝脏组织加入2.4ml线粒体悬浮液），4℃保存备用。

mPTP形成与开放用高钙法诱导。将100μmol／LCa2＋加入线粒体悬液10 min，然后将各组线粒体离心15min（4℃，14 000×g），上清按适当比例与 5×loading buffer混匀，沸水煮8min。冰上冷却后，离心 5min（3 000 r／min，4℃），-20℃保存。上清与沉淀进行 Cyt c半定量［4］。

1.7 数据分析

数据处理采用Excel与Igor Pro，以均数±标准差（±s）表示［4］。单因素方差（One-way ANOVA）分析用Igor Pro软件进行。

2 结果

2.1 小剂量过氧化氢预处理改善再灌注心功能下降

本实验中，我们首先在全心脏水平建立缺血／再灌注损伤模型（I／R组），然后比较反复（3次）短暂（5 min）小剂量（10μmol／L）过氧化氢预处理（H2O2组）与经典IPC改善心脏功能效能（图1）。按照惯例，我们采用左心室发展压（LVDP）与等容收缩期左室内压上升最大速率（dp／dtmax）作为衡量心功能的指标（图2），用灌流液的乳酸脱氢酶（LDH）活性作为心肌再灌注损伤的指标（图3）。结果显示，再灌注1 h后，H2O2组和 IPC组的 LVDP（I／R组：（36±6.2）mmHg；IPC组：（63±4.8）mmHg；H2O2组：（77±5.3）mmHg）与 dp／dtmax（I／R组：（28±3.5）mmHg／s；IPC组：（58±3.1）mmHg／s；H2O2组：（56±5.8）mmHg／s）恢复均显著好于IR组（图2），而H2O2预处理的效果与IPC相当。LDH活性测量结果进一步支持H2O2预处理的效果与 IPC相当（Sham组：100%；I／R组：（320±65）%；IPC组：（130±23）%；H2O2组：（180±31）%（图3）。这些结果提示，小剂量过氧化氢预处理能够模仿经典IPC对再灌注损伤的保护作用。

2.2 短暂缺血导致小剂量过氧化氢生成

由于小剂量过氧化氢预处理能够模仿经典IPC对再灌注损伤的保护作用，我们推测在短暂缺血期间，心肌细胞应该能够产生低浓度过氧化氢。为了检验这个假设，我们采用一个经典缺血／再灌注细胞模型［5］，实验细胞为大鼠H9c2心肌细胞系，用鱼藤酮（rotenone）造成细胞缺氧，以H2-DCFDA作为检测H2O2的指标，该染料遇H2O2氧化时会发出绿色荧光。结果显示，对照组（DMSO处理）细胞在连续观察的1 h内没有显示明显的H2-DCFDA荧光，而鱼藤酮处理组细胞在约1 min时就显示H2-DCFDA绿色荧光，且荧光强度逐渐增加（图4）。因此，短暂缺血确实能导致过氧化氢产生。

Fig.4 Rotenone-induced H2O2 production in H9c2 cardiac myocytes（H2-DCFDA×20）

2.3 小剂量过氧化氢预处理减少线粒体钙诱导的细胞色素c释放

以往研究显示，小剂量过氧化氢预处理能够减轻线粒体钙超载，因此推测小剂量过氧化氢可能减少mPTP形成与开放，从而改善再灌注后心功能恢复。如果这个假设成立，那么小剂量过氧化氢预处理应该减少细胞色素c释放，这可以在线粒体水平得到直接证实。我们采用经典的肝脏线粒体细胞色素 c释放模型，以100μmol／L Ca2＋模仿再灌注时的条件刺激mPTP形成与细胞色素c释放，用Western blot检测上清中细胞色素 c释放量。结果显示，Ca2＋处理10min能导致约70%Cyt c释放，用1～100 μmol／L H2O2预防处理10 min后，发现 H2O2在1～5 μmol／L时明显减少高钙刺激的Cyt c释放（图5，P＜0.05）。因此，我们的结果显示在线粒体水平，小剂量过氧化氢预处理的确减少高钙诱导的细胞色素c释放。

Fig.5 Effects of H2O2 pretreatment on Ca2＋-induced cytochrome crelease（n＝3）

3 讨论

mPTP形成与开放是再灌注损伤一个关键的临床干预点［6］，我们推测可能是 H2O2的一个下游目标。虽然有关mPTP的分子身分仍然是一个迷，促进或抑制mPTP的形成与开放的许多因素已经被鉴定出来，如蛋白激酶（PK）Cε的激活能够抑制mPTP开放，从而与IPC有明确关系。PKC含有锌指结构（zinc finger），对 H2O2非常敏感［7］，因此可能是后者保护再灌注损伤的机制之一。

另一个明确的H2O2下游目标是同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）［8］。H2O2通过失活PTEN而激活PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）-Akt信号通路。该信号通路包括一系列公认的促进存活蛋白分子，从而发挥心肌保护作用。

上述的PKC、Akt都属于“再灌注损伤拯救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）家族，其他具有心肌保护作用的成员如MAPK与JAK-STAT都是氧化还原（redox）敏感蛋白激酶，他们可能是H2O2的下游靶点，参与H2O2的心肌保护作用。

关于短暂缺血期间低水平H2O2产生的部位还不明确。早期结果提示，呼吸链复合体I和III是主要位点，本实验中采用的鱼藤酮其实也是复合体I的抑制剂，但最近发现复合体II产生的H2O2接近或超过复合体I或III。复合体II作为产生H2O2的位点将能揭开许多有关IPC的谜团。很久以前就知道，H2O2的产生与线粒体 ATP敏感钾通道（mitoKATP）密切相关，阻断 mitoKATP能够阻断 H2O2的产生与IPC。最近的结果显示，复合体II可能就是mitoKATP［9］。目前我们实验室正在进行相关研究工作。

心肌保护也可以通过使用某些药物来实现，如鸦片类、缓激肽与苯肾上腺素。这类药物都是与抑制型G蛋白（Gi）相偶联，导致H2O2产生，中和H2O2将阻断这些药物的心肌保护作用［10］。不过这些药物导致H2O2产生的部位不在线粒体，很可能是在细胞膜NADPH氧化酶。

综上所述，本实验从整体、细胞和线粒体水平分别证实了小剂量H2O2预处理能够切实改善心脏功能，短暂缺氧导致H2O2产生，而小剂量H2O2预处理减少钙超载诱导的mPTP形成与开放。

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