胆碱对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的促进作用*

汪 汇，曾祥芝，崔文玉，段 炼△

（1.军事医学科学院附属医院，北京100071；2.北京赛德维康医药研究院，北京100039；3.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，北京100850）

血管新生（angiogenesis）是指产生新的血管或从已存在的血管形成毛细血管的过程，不仅存在于机体生长发育的全过程，更是在创伤修复、缺血缺氧、炎症等多种疾病或病理过程中扮演着重要的角色［1］。心肌组织缺血可促进血管新生，而胆碱能够显著促进心肌组织缺血诱导的血管新生，改善心肌缺血损伤，产生分子搭桥（molecular bypass）的生物效应［2］。胆碱属B族维生素，不良反应小，毒性小；进一步的研究表明胆碱为烟碱受体α7亚型（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）的激动剂，血管内皮细胞α7受体参与体内血管新生的调节，为胆碱调节血管新生的分子靶标。

烟雾病（moyamoya disease）又称自发性基底动脉环闭塞症，是一种原因不明的以双侧颈内动脉及大脑前、中动脉起始部动脉管腔逐渐狭窄以致闭塞，脑底穿通动脉代偿性扩张为特征的疾病，其发生、发展和转归过程中血管新生发挥了重要的作用［3］。烟雾病的手术治疗通过直接或间接血管重建等方式形成颅内外血管沟通，建立缺血脑区的侧枝循环，改善脑缺血损伤［4］。缺血脑区对血管新生的促进作用，直接影响其治疗效果。脑血管内皮细胞存在α7受体的表达，因此，研究胆碱对脑组织缺血诱导血管新生的影响，对于寻找烟雾病综合治疗新技术有重要价值。本研究以鸡胚绒毛尿囊膜（chick embryo chorioallantoicmembrane，CAM）血管新生为模型［5］，评价胆碱对血管新生的影响，为研究促进血管新生的治疗新技术提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

受精鸡卵购自北京蓝风家禽养殖有限公司；氯化胆碱购自美国Sigma-Aldrich公司；hVEGF购自美国PerproTech公司；混合纤维素微孔滤膜（孔径0.45 μm）购自北京升河诚信膜科技发展中心；打孔器制成直径0.6 cm的圆片载体，120℃20 min高压湿热灭菌，无菌生理盐水浸泡两次后备用；LRH-250生化培养箱。

1.2 药物对血管新生影响的检测

受精鸡卵以1‰新洁尔灭清洗后放入37.5℃，60%相对湿度的孵箱内孵育，钝端向上与蛋托呈45度角，每天翻转至少2次。孵育至第7天时（满24 h为一天），在照蛋器指示下，用铅笔标记出鸡卵气室区域。将鸡卵移至超净工作台中，酒精棉球消毒后，用砂轮磨切蛋壳。待磨出一凹痕后，用牙探针的尖端勾开蛋壳，用眼科弯镊小心夹去蛋壳及壳膜，窗口大小由气室大小决定，一般距离气室底边约0.5 cm。滴加2滴生理盐水使鸡胚绒毛尿囊膜下塌，与卵壳膜分离，去除卵壳膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜。

将甲基纤维素微孔滤膜载体置于鸡胚绒毛尿囊膜上相对无血管区域，用微量移液器向载体上滴入20μl药物，透明胶带封口，继续孵育3 d，不再翻转。

继续孵育至第11天，揭去胶带，向鸡胚绒毛尿囊膜上滴入等量甲醇、丙酮配成的固定液，固定15 min，剪下鸡胚绒毛尿囊膜，平铺于玻片上，用数码相机摄片［6］。以载体为中心，计数载体周围0.3 cm范围处与计数环相交叉的的血管数。

1.3 实验分组

第一批实验共分8组（n＝11）：生理盐水组、hVEGF阳性对照组（1μg／L）、氯化胆碱 0.01、0.1、1、10、100和 1 000μmol／L组。第二批实验共分 7组（n＝11）：生理盐水组、hVEGF阳性对照组（1μg／L）、氯化胆碱 0.1、0.5、1、5和 10 nmol／L组。

1.4 统计学处理

实验数据均用均数±标准差（±s）表示，采用Excel进行统计分析，组间差异采用t检验。

2 结果

2.1 鸡胚存活情况

存活鸡胚的胚体活动活跃，动脉血管搏动有力，CAM透明，血管呈叶脉状分布，颜色鲜红，脉络清晰。死亡鸡胚的胚体上浮，颜色发白，活动停止，CAM血管颜色浅淡，脉络消失。第一批实验鸡胚孵化成功率为 91.0%，第二批实验孵化成功率为86.2%。

2.2 氯化胆碱对CAM血管新生的促进作用

氯化胆碱 0.01～1 000μmol／L各浓度组和hVEGF组血管数均多于生理盐水组，具有显著性差异（表1，图1）；氯化胆碱各浓度组与hVEGF阳性对照组之间相比均无显著性差异，表明氯化胆碱可促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生。

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 9 23.67±3.29 Choline 0.01 10 31.90±6.05**（μmol／L） 0.1 10 28.95±4.32*1.0 10 29.15±3.37**10 8 28.13±4.26*100 11 29.45±6.85*1000 9 31.22±7.28*hVEGF（μg／L） 1 7 30.14±4.38 Group Doses n**

Fig.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick chorioallantoicmembranes

2.3 氯化胆碱对促进CAM血管新生作用的最低有效剂量浓度

为研究氯化胆碱促进血管新生的最低有效浓度，实验中胆碱浓度从 10 nmol／L进一步降至 0.5 nmol／L，结果显示氯化胆碱浓度在 0.5～5 nmol／L时无促进血管新生的作用，当剂量浓度增至10 nmol／L时具有促进血管生成的作用，新生血管的数量多于生理盐水对照组（表2，图2）。表明氯化胆碱促进血管新生的最低有效浓度为10 nmol／L。

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 7 33.43±8.62 Choline 0.1 11 35.14±9.46（nmol／L） 0.5 8 30.57±6.88 1 10 33.28±3.64 5 9 37.11±6.97 10 10 47.30±6.65**hVEGF（μg／L） 1 7 41.71±5.12 Group Doses n*

3 讨论

CAM是鸡胚外的一层膜，主要功能是提供进行气体交换的表面，同时CAM功能的行使也依赖于致密的血管网的支撑，正是由于鸡胚发育过程中大量尿囊膜血管的形成，为研究血管发生和形成提供了很好的实验模型。由于鸡胚早期免疫系统发育不全，对所加测试药物不会产生排斥反应，实验结果可在显微镜甚至肉眼下直接观察。同时，此模型实验材料易得、操作简便、实验周期短、成本较低，因此CAM模型成为研究血管形成的一种理想模型［6］。

本研究应用鸡胚绒毛尿囊膜作为实验模型，发现胆碱可促进血管新生。目前认为hVEGF为最强的促进血管新生的生物因子，在本实验条件下，发现氯化胆碱促进血管新生的作用强度与hVEGF相当。另一方面，其最低有效浓度低，仅为10 nmol／L；有效浓度范围宽，为 10 nmol／L～1 mmol／L之间，且氯化胆碱各浓度组之间无显著性差异，提示临床应用胆碱促进血管新生的剂量易于控制。

胆碱作为α7受体的配体，可激活和失敏α7受体［7］。一方面，胆碱激活α7受体能够增加胞内Ca2＋释放、内皮细胞增殖及体外血管索形成，促进血管新生和缺血心肌区侧枝循环的建立［8］。另一方面，胆碱的有效浓度范围宽，可能与其可诱导α7受体功能失敏有关，避免过度激活α7受体，调控其促进血管新生的作用。

应用药物促进血管新生，刺激缺血区小血管生长，促进侧枝循环形成，目前已经成为缺血性心脑血管疾病及其治疗技术研究领域的热点之一。本研究发现胆碱促进血管新生作用不仅作用强，而且有效剂量范围宽。由于胆碱的安全性好，毒性低，不良反应小，因此，以胆碱作为促进血管新生的新技术具有进一步的研究价值。

【参考文献】

［1］ Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9（6）：653-660.

［2］ Li XW，Wang H.Non-neuronalnicotinic alpha 7 recepor，a new endothelial target for revascularization［J］.LifeSci，2006，78（16）：1863-1870.

［3］ Saito N，ImaiH.Insights on the revascularizationmechanism for treatment of Moyamoya disease based on the histopathologic concept of angiogenesis and arteriogenesis［J］.World Neurosurg，2011，75（2）：204-205.

［4］ 韩 聪，段 炼，杨伟中，等.烟雾病的外科治疗［J］.中国卒中杂志，2008，3（7）：509-512.

［5］ 刘静霞，龙超良，包存刚，等.靶向内皮细胞α7受体的新化合物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9（7）：747-750.

［6］ 师明磊，段海峰，胥照平，等.在鸡胚绒毛尿囊膜上评价血管生成技术的应用与优化［J］.生物技术通讯，2008，19（4）：566-568.

［7］ Wang Y，Pereira E F，Maus A D，etal.Human bronchial epithelial and endothelial cells expressα7 nicotinic acetylcholine receptors［J］.MolPharmacol，2001，60（6）：1201-1209.

［8］ 陈 凯，汪 海.血管内皮细胞非神经性乙酰胆碱系统的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2005，10（3）：254-285.