胶原诱导性关节炎小鼠的淋巴组织中CD4＋T细胞表达酪氨酸羟化酶的变化*

陈 娟，彭聿平，崔世维，包，邱一华△

（1.南通大学医学院生理学系，江苏南通226001；2.南通大学附属医院内分泌科，江苏南通226001；3.南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科，江苏淮安223001）

长期以来儿茶酚胺被认为是由神经和内分泌细胞合成和释放的一类调节物。然而，近十多年来的研究发现，淋巴细胞也能合成和分泌儿茶酚胺［1，2］。本实验室先前已报道，T淋巴细胞表达儿茶酚胺合成的限速酶--酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH），而且可合成和释放儿茶酚胺，包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺，它们对T细胞的增殖、分化和凋亡产生调节作用［3-6］。已知类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以对称性多关节炎为主要表现的慢性自身免疫性疾病，其发病机制主要与CD4＋T细胞中各类亚群的功能失衡有关。如前所述，在正常情况下T细胞来源的儿茶酚胺可调节免疫功能，那么在RA慢性自身免疫性疾病的发生与发展中，T细胞是否发生儿茶酚胺合成的改变，目前尚不十分清楚。据此，本研究利用RA的小鼠模型--胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA），观察CIA疾病过程中CD4＋T细胞表达TH的变化，从而为T细胞来源的儿茶酚胺参与RA的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

DBA／1小鼠雄性，6～8周龄，体重为（18±2）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，SPF级，室内适应性喂养一周后用于实验。将体重相近的DBA／1小鼠随机分为未处理空白组、佐剂组、35 d模型组和55 d模型组。

1.2 主要试剂与仪器

鸡Ⅱ型胶原（collagenⅡ，CⅡ）购自 Sigma公司；佛氏完全佐剂（complete freund′s adjuvant，CFA）购自Chondrex公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自Sigma公司；小鼠抗TH单克隆抗体购自Millipore公司；大鼠抗小鼠 CD4抗体购自 AbD Serotec公司；FITC羊抗小鼠抗体购自Sigma公司；罗丹明标记山羊抗大鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Leica倒置研究型显微镜、CM 1900型冰冻切片机购自德国 Leica公司。

1.3 CIA模型制备

取CⅡ溶于0.1 mol／L的冰醋酸溶液中使终质量浓度为2mg／ml，置4℃储存过夜。取上述 CⅡ溶液与CFA等体积混合，于冰上充分乳化制成胶原乳剂。免疫动物时，在小鼠尾根部多点皮内注射0.1 ml胶原乳剂，基础免疫后第21天在腹腔注射该胶原乳剂0.1ml进行加强免疫，为了加速关节炎发生分别于第28天、第32天腹腔注射LPS 20μg。佐剂组是用CFA与0.1 mol／L的冰醋酸溶液等体积充分乳化后于实验第1天在每只小鼠的尾根部多点皮内注射0.1ml乳剂，第21天在腹腔注射该乳剂0.1ml。

1.4 关节炎症的观察和临床评分

小鼠在初次免疫后每天观察前后足的病变情况；并在初次免疫后第22天开始，每3 d进行关节炎症的临床评分，各关节病变程度按4级评分法［7］。“0”：所有的关节无任何肿胀或变红；“1”：轻度的红和（或）肿；“2”：明显的红肿；“3”：关节僵硬或畸形强直。每只小鼠所有关节均被评分，最高分为12分。

1.5 踝关节组织病理学检查

小鼠在初次免疫后第35天和55天分别处死，取踝关节，剥离皮肤后，去除多余的皮下组织，关节用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，切片，HE染色，光镜下观察组织病理变化。

1.6 免疫荧光组织化学染色

小鼠在初次免疫后第35天或55天，用复合麻醉剂2ml进行腹腔麻醉后，灌注、固定、取肠系膜淋巴结和脾脏，冰冻切片，片厚20μm，PBS漂洗，加山羊血清封闭30 min，PBS漂洗，加一抗即小鼠抗TH单克隆抗体（1∶150稀释）和大鼠抗小鼠CD4抗体（1∶300稀释），室温孵育 18～24 h，PBS漂洗，加二抗即FITC羊抗小鼠抗体（1∶100稀释）和罗丹明标记山羊抗大鼠 IgG（1∶150稀释），室温孵育4 h，PBS漂洗3次，上述抗体均用0.01 mol／L PBS稀释。将上述处理过的组织切片裱于经明胶处理过的载玻片上，用封片剂封片。在同一视野荧光显微镜下观察，淋巴结和脾脏各切片随机选择5个区域进行照相，然后统计每张切片中阳性细胞数。

1.7 统计学处理

各组数据采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 11.0统计软件中单因素方差（one-way ANOVA）分析进行数据的处理和比较。

2 结果

2.1 DBA／1小鼠注射胶原乳剂后关节炎症的观察

小鼠的关节红肿多发生于初次免疫后的第29～32天，首先是前足红肿，以后延伸至后足，亦可同时出现，病变可累及足垫、趾间关节及踝关节，并逐渐加重，于初次免疫后第46天左右红肿达到高峰；初次免疫后35 d和初次免疫后55 d小鼠关节红肿无明显差异（图1）。而正常组和佐剂组无关节红肿表现（图1）。另外，在发病过程中，模型小鼠出现饮食及运动减少、舔足、毛色失去光泽、尾根部注射处有溃烂等现象。

2.2 DBA／1小鼠注射胶原乳剂后关节炎症的临床评分

小鼠自初次免疫后第22天开始，每3 d进行关节炎症的临床评分。可见DBA／1小鼠注射胶原乳剂后足爪分值从第29天开始升高，第46天达高峰，临床评分达8.8分，与足爪肿胀外观一致；而正常组和佐剂组均为0分（图2）。

Fig.1 Photographs of swelling paws of DBA／1mice with CIA CIA：Collagen-induced arthritis

Fig.2 Change in clinical scores of arthritis in process of CIA（n＝5）

2.3 DBA／1小鼠注射胶原乳剂后踝关节组织病理学的改变

小鼠在初次免疫后第35天和55天分别处死，取踝关节，标本经固定、脱钙、切片并进行HE染色。观察病理切片发现CIA小鼠在发病早期（初次免疫后第35天）和发病晚期（初次免疫后第55天）其关节滑膜组织中炎性细胞浸润、滑膜组织增生、关节间隙变窄、部分关节软骨破坏；而正常组和佐剂组可见关节结构清楚，未见明显炎性细胞浸润、滑膜组织增生和软骨破坏等异常改变（图3）。

2.4 CIA小鼠肠系膜淋巴结中CD4＋T细胞表达TH增加

与正常组和佐剂对照组相比，CIA小鼠在发病早期和发病晚期均出现肠系膜淋巴结中TH＋细胞数目明显增多，而且CD4＋T淋巴细胞数目也显著增加（图4，表1）。我们将 TH＋细胞和CD4＋T淋巴细胞进行共定位，发现在正常淋巴结中，有TH＋和CD4＋细胞的共定位，证明CD4＋T细胞表达TH。在CIA小鼠的发病早期和发病晚期，淋巴结中具有TH＋和CD4＋共定位的细胞数均显著多于正常组和佐剂对照组（图4，表1），说明在 CIA发病过程中，CD4＋T细胞表达TH增加。在CIA小鼠的发病早期与发病晚期之间，TH＋细胞、CD4＋T细胞及它们共定位的细胞数目均没有显著性差异（图4，表1）。

Fig.3 Histopathological changes in ankle jointof CIA（HE staining）

Fig.4 The expression of TH and CD4 in the mesenteric lymph nodes detected by double immunofluorescence staining（×200，insert×400）

2.5 CIA小鼠脾脏中CD4＋T细胞表达TH增加

与正常组和佐剂对照组相比，CIA小鼠在发病早期和发病晚期均出现脾脏中TH＋细胞数目明显增多，并且CD4＋T淋巴细胞数目也显著增加（图5，表2）。我们将TH＋细胞和CD4＋T淋巴细胞进行共定位，发现在正常脾脏中，有TH＋和CD4＋细胞的共定位，证明CD4＋T细胞表达TH。在CIA小鼠的发病早期和发病晚期，脾脏中具有TH＋和CD4＋共定位的细胞数均显著多于正常组和佐剂对照组（图5，表2），说明在CIA发病过程中，CD4＋T细胞表达TH增加。在CIA小鼠的发病早期与发病晚期之间，TH＋细胞、CD4＋T细胞及它们共定位的细胞数目均没有显著性差异（图5，表2）。

Tab.1 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice（±s，n＝4）

Tab.1 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in themesenteric lymph nodes of CIAmice（±s，n＝4）

TH：Tyrosine hydroxylase；CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs vehicle

Group Number of TH＋cells double-positive cells Intact 27.00±10.80 19.75±9.95 14.00±4.83 Vehicle 30.00±13.74 22.75±13.57 16.25±5.97 Day 35 after immunization 127.50±60.89**＃＃ 89.00±51.06**＃＃ 51.00±21.65**＃＃Day 55 after immunization 104.00±27.51**＃ 78.25±19.92*＃ 52.75±15.90**＃＃Number of CD4＋cells Number of TH／CD4

Tab.2 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice（±s，n＝4）

Tab.2 Changes in number of TH／CD4 double-positive cells in the spleen of CIAmice（±s，n＝4）

TH：Tyrosine hydroxylase；CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact；＃P＜0.05 vs vehicle

Group Number of TH＋cells double-positive cells Intact 14.25±3.40 9.75±4.03 6.00±2.58 Vehicle 14.50±4.12 11.75±2.50 5.25±1.71 Day 35 after immunization 28.75±11.79*＃ 21.75±5.74**＃ 13.25±6.75*＃Day 55 after immunization 25.75±5.56*＃ 20.50±6.61*＃ 13.50±4.80*＃Number of CD4＋cells Number of TH／CD4

Fig.5 Expression of TH and CD4 in the spleen detected by double immunofluorescence assay（×200，insert×400）

3 讨论

神经-内分泌-免疫调节网络主要通过合成和释放递质、激素、细胞因子等发生相互作用从而调节生物体的生理功能。儿茶酚胺包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺，它们主要由神经和内分泌细胞合成和释放。但近十多年来的研究说明，免疫细胞也能产生儿茶酚胺，并对免疫系统产生调节作用［1-2］。免疫细胞具有与神经内分泌细胞类似地合成和降解儿茶酚胺的酶系统。例如，用TH抑制剂α-甲基酪氨酸预孵育T或B淋巴细胞后，细胞内儿茶酚胺的含量明显下降，提示淋巴细胞内儿茶酚胺的合成依赖于TH［8］。我们先前已报道，淋巴细胞能表达儿茶酚胺合成的限速酶—TH；同时直接检测到培养的淋巴细胞内和上清液中有去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺，表明淋巴细胞可合成和分泌儿茶酚胺；淋巴细胞合成和分泌的儿茶酚胺对T细胞的增殖、凋亡和细胞因子的产生发挥调节作用［3-6］。然而，淋巴细胞来源的儿茶酚胺是否参与免疫性疾病的发病机制尚不十分清楚。

RA是一个累及周围关节为主的多系统性炎症性的自身免疫病，临床表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降，病变呈持续、反复发作的过程，其发病机制至今尚未完全阐明。1980年Courtenay等建立了小鼠CIA模型，极大的推进了RA发病机制和治疗的研究。小鼠CIA作为类似于RA的实验动物模型，表现为多发性外周关节炎，关节局部红肿，严重致关节畸形。病理变化为增生性滑膜炎，关节软骨破坏、骨侵蚀，关节腔内有炎性细胞浸润，体内可检出针对Ⅱ型胶原的高滴度的IgG抗体，这些临床表现及实验指标与人类RA密切相关。本实验中我们以鸡的CⅡ免疫6～8周雄性DBA／1小鼠，免疫后模型组多于第29～32天开始出现关节红肿等关节炎症表现，关节炎评分逐渐升高，第46天达到高峰，观察病理切片发现CIA小鼠在发病早期和发病晚期其关节滑膜组织中有大量炎性细胞浸润，滑膜组织增生，关节间隙变窄，部分关节软骨破坏。这些病理改变及体征与文献报道一致，提示CIA模型制备成功。

Miller等［9］报道，RA病人的关节滑膜组织中巨噬细胞释放去甲肾上腺素，而且随着关节炎症的加重，巨噬细胞释放去甲肾上腺素增加。这一研究提示作为固有免疫细胞的巨噬细胞可合成和释放儿茶酚胺，这些儿茶酚胺与RA的发病机制有关。CD4＋T细胞是适应性免疫细胞--T细胞的一种亚群。我们研究发现，在正常小鼠的淋巴结和脾脏中，也存在TH＋和CD4＋共定位的细胞，但在CIA小鼠的发病早期和发病晚期，其肠系膜淋巴结和脾脏中的TH＋细胞数目和CD4＋T细胞数目显著增多，而且TH＋和CD4＋共定位的细胞数目也明显增多。这些结果不但说明在正常淋巴组织中CD4＋T细胞能合成儿茶酚胺，而且提示T细胞合成的儿茶酚胺也参与了RA的疾病过程，因而为适应性免疫细胞来源的儿茶酚胺涉及 RA的发生及转归提供了证据。最近，Capellino等［10］报道在 RA疾病的初期，关节炎局部的细胞产生儿茶酚胺增加，这些儿茶酚胺具有很强的抗炎作用。因此，我们推测在RA疾病过程中T细胞合成儿茶酚胺增加是一种局部的抗炎机制。

【参考文献】

［1］ Cosentino M，Fietta A M，Ferrari M，etal.Human CD4＋CD25＋regulatory T cells selectively express tyrosine hydroxylase and contain endogenous catecholamines subserving an autocrine／paracrine inhibitory functional loop［J］.Blood，2007，109（2）：632-642.

［2］ Engler K L，Rudd M L，Ryan JJ，etal.Autocrine actions ofmacrophage-derived catecholamines on interleukin-1β［J］.JNeuroimmunol，2005，160（1-2）：87-91.

［3］ Jiang JL，Peng Y P，Qiu Y H，etal.Adrenoreceptor-coupled signal-transduction mechanisms mediating lymphocyte apoptosis induced by endogenous catecholamines［J］.JNeuroimmunol，2009，213（1-2）：100-111.

［4］ Jiang JL，Peng Y P，Qiu Y H，etal.Effect of endogenous catecholamines on apoptosis of Con A-activated lymphocytes of rats［J］.JNeuroimmunol，2007，192（1-2）：79-88.

［5］ Qiu YH，Cheng C，Dai L，etal.Effectofendogenous catecholamines in lymphocytes on lymphocyte function［J］.J Neuroimmunol，2005，167（1-2）：45-52.

［6］ Qiu YH，Peng Y P，Jiang JM，etal.Expression of tyrosine hydroxylase in lymphocytes and effect of endogenous catecholamines on lymphocyte function ［J］.Neuroimmunomodulation，2004，11（2）：75-83.

［7］ Williams RO，Feldmann M，MainiRN.Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1992，89（20）：9784-9788.

［8］ Cosentino M，BombelliR，FerrariM，etal.HPLC-EDmeasurement of endogenous catecholamines in human immune cells and hematopoietic cells lines［J］.LifeSci，2000，68（3）：283-295.

［9］ Miller L E，Justen H P，Scholmerich J，etal.The loss of sympathetic nerve fibers in the synovial tissue of patientswith rheumatoid arthritis is accompanied by increased norepinephrine release from synovial macrophages［J］.FASEB J，2000，14（13）：2097-2107.

［10］ Capellino S，Cosentino M，Wolff C，etal.Catecholamineproducing cells in the synovial tissue during arthritis：modulation of sympathetic neurotransmitters as new therapeutic target［J］.AnnRheumDis，2010，69（10）：1853-1860.