神经型犬瘟热病毒鸡胚培养实验

李兰兰，刘伟姣，肖波，张山珊，郭佳慧，贾杏林

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

犬瘟热（Caninedistemper，CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种严重传染病，属于副粘病毒科的麻疹病毒属[1]。CDV可以感染不同年龄、性别和品种的狗。除犬科动物外，许多动物种类，例如猫科，鼬科，浣熊科和灵长类动物也易感染CDV[2]。该病在我国的爆发流行最早要追溯到于1968年爆发该病的黑龙江省抚远县某貂场。此后，该病的流行由华北地区逐渐蔓延到华南、华中地区，直至上世纪80年代已有九省三十多县市七十多个毛皮动物养殖场遭受该病的侵袭[3]。

随着经济水平的提高，越来越多的人开始养宠物，犬瘟热也成为我们身边常见的宠物疾病。该病对犬危害极大，致死率极高。尤其是神经型犬瘟热,病犬大都预后不良,就算被治愈，也会留下抽搐的后遗症。其抽搐的症状可随时间的推移而减轻,但终不消失[4]。该病严重威胁养犬业的健康可持续发展[5]，因此犬瘟热病毒的分离培养对犬瘟热的检测及疫苗制备极其重要。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验器材

网购小型中信孵化箱、生化培养箱、无菌操作台、高压蒸汽锅、酒精灯、镊子、凿蛋器、匀浆器、组织剪、一次性注射器、蛋架、神经型犬瘟热病例肺脏，犬瘟热快速检测试纸（Anigen Rapid）、卫佳伍疫苗(硕腾公司)

1.1.2 实验药剂

硫酸链霉素(圣旺药业)、阿莫西林克拉维酸钾（山东鲁抗医药股份有限公司）、0.9%氯化钠（山东科伦药业有限公司）

1.2 实验方法

1.2.1 鸡胚培养

鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种方法，是病毒培养学的重要方法之一。

鸡胚应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋，用孵化箱孵化，选择相对湿度为60%，最低温度36℃，一般37.5℃的条件下进行孵化。

分6个批次按照上述培养方法培养，记录并挑选相应批次发育正常的鸡胚的数目。

1.2.2 接种方法

病料为可能被污染的固体材料，在取样剪碎研磨后，加入研磨液十分之一量的双抗，置于冰箱12~24小时。

将孵化9~12日龄后的鸡胚放在照蛋器下，用铅笔勾出气室以及接种部位。

将鸡胚放置在无菌工作台中，依次使用75%酒精—碘酒—75%酒精的方法进行消毒，使用凿蛋器进行打孔。

将病料或鸡胚液从孔中注射入要接种的部位，用石蜡封孔后于37℃生化培养箱中孵育5天。

实验采用卵黄囊接种和尿囊腔接种的方法。

1.2.3 胚液提取方法

弃去48h内死亡鸡胚，将接种5天后未死亡鸡胚放入冰箱冻死。

将收获的鸡胚从冰箱取出，在无菌环境下提取胚液。按照75%酒精—碘酒—75%酒精的顺序消毒蛋壳，再用镊子打开鸡胚气室，撕开气室膜和尿囊腔膜使用注射器吸取胚液，将胚液置于干净抗生素瓶中，放于冰箱冷藏保存。

1.3 实验设计

第1~3批采用的是卵黄囊接种不同剂量研磨液。

第1批中，将培养出来的正常的鸡胚，随机编号分组，分别接种0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL等梯度剂量的研磨液。

第2批中，将培养出来的正常的鸡胚，随机编号分组，以第1批培养的鸡胚夜作为接种物，每组设置的剂量梯度为0.1mL、0.2mL、0.3mL。

第3批中，以养殖场土鸡蛋作为受精鸡胚，按照第一批中的方法和梯度剂量试验。

第4批还是采用的是卵黄囊接种不同剂量研磨液，但研磨液经离心机中以10000r/min速度离心10 min后取上清液。以第三批批鸡胚培养时的研磨液、卫佳伍疫苗作为接种对照，进行分组试验。

第5批采用的接种方法是尿囊腔接种，从鸡胚侧面开孔，避开血管注射。该批次鸡胚培养研磨液放于离心机中以10000r/min的速度离心10min，取上清液；以第4批2枚鸡胚分别接种0.1mL和0.2mL的卫佳伍疫苗作为对照试验。

第6批采用同第五批一样的尿囊腔接种，该批次的鸡胚培养研磨液放于离心机中以10000 r/min的速度离心10min，取上清液，正常的鸡胚编号，每个编号添加研磨上清液0.3mL。

1.4 胚液检测方法

提取每个批次中可以检测的胚液适量，用于检测。

（1）将少量胚液滴在试纸板上，若浓度过大使用吸管吸取胚液至稀释液中搅拌后滴在试纸板上，等待10~15min观察结果。

（2）根据检测线与对照线的结果判断阴性和阳性。对照线位置出现红色条带试验成立，如果测试线位置出现红色条带则判为CDV阳性，如果测试线位置不出现红色条带则判为CDV阴性。

2 结果与分析

2.1 鸡胚培养

第1、2批采用SPF鸡胚,以卵黄囊接种方法分别培养出12枚、15枚发育正常的鸡胚。

第3批采用农村养殖场土鸡蛋，以卵黄囊接种方法培养出7枚发育正常的鸡胚。

第4批采用SPF鸡胚,以卵黄囊接种方法但研磨液经过高速离心后培养出13枚发育正常的鸡胚。

第5、6批采用SPF鸡胚,采用的是尿囊腔接种，研磨液经过高速离心,分别培养出13枚、8枚发育正常的鸡胚。

2.2 CDV病毒培养结果

鸡胚接种病毒研磨液后进行病毒培养后收获鸡胚尿囊液，每个批次鸡胚液进行CDV试纸检测，从表1可知，第1批接种12枚鸡胚，1枚鸡胚尿囊液检测CDV阳性；第4批接种13枚鸡胚，1枚鸡胚尿囊液检测CDV阳性；第5批接种13枚鸡胚，6枚鸡胚尿囊液检测CDV阳性；第6批接种8枚鸡胚，1枚鸡胚尿囊液检测CDV阳性。卫佳伍疫苗接种2枚鸡胚，1枚鸡胚尿囊液检测CDV阳性。

表1 六次鸡胚培养结果

本次实验先后采用卵黄囊接种及尿囊腔接种的方法，并尝试接种病料研磨液和病料研磨上清液，最终成功提取出神经性犬瘟热病毒液。

由表1可以看出，第五批更换了接种方法，改为从侧面尿囊腔接种病料研磨上清液后，检验结果与前几次实验相比较为良好，且鸡胚存活率较前几次实验有明显提升，表明使用侧面接种尿囊腔相比于使用气室接种卵黄囊更不容易伤及鸡胚。第六批鸡胚培养相比第五批，接种时增大了病毒研磨上清液的剂量，实验结果显示接种后八枚鸡胚仅有一枚含有CDV，推测是由于本次病毒液的剂量过大导致，表明鸡胚接种犬瘟热病料研磨上清液最佳接种量是0.25mL。

3 讨论

在第一批鸡胚培养中，将鸡胚分6组进行不同剂量研磨液的接种，虽然可以避免出现浓度过高或过低导致鸡胚实验结果不理想的状况，但是每组实验对象较少，对照实验结果不明显；第二批均未培养出病毒，猜测可能是第一批培养出的病毒浓度过低，活性较弱，或是接种过程中被污染，所以在鸡胚接种过程中一定要在无菌条件下进行，避免外界对鸡胚造成污染导致鸡胚死亡；第三批鸡胚培养使用的受精鸡胚为农村养殖场土鸡蛋，实验结果是全部鸡胚死亡，推测是猜测可能母源抗体量较高导致全部鸡胚死亡，因此在鸡胚接种培养实验中使用SPF鸡胚较好。

六次鸡胚培养获得的阳性结果中，试纸检测线颜色相对于对照线均较浅，表明鸡胚接种培养犬瘟热病毒虽能成功培养出病毒，但培养出的病毒浓度较低。对于如何在鸡胚接种培养犬瘟热病毒实验中提高培养出的病毒液的效价还需要进一步研究。□