内毒素血症大鼠膈肌iNOS活性和凋亡相关基因表达的变化*

方迎艳，关宿东，郭晓磊，叶红伟，汪华学，高 琴△

（1.蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠233030；2.蚌埠医学院第一附属医院ICU，安徽 蚌埠233004）

内毒素的主要成分脂多糖是细菌致病的主要物质之一，进入机体可引起内毒素血症或脓毒血症，导致机体多器官损伤和功能障碍。呼吸功能障碍是内毒素血症最常见、致命的并发症之一，内毒素血症休克病程中膈肌收缩功能严重损伤，与结构型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）和诱导型 NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）显著激活有关［1，2］。近年来研究观察到，内毒素引起的膈肌损伤与局部炎性细胞因子产生过多、氧自由基明显增加和蛋白质水解途径（钙蛋白酶和半胱天冬酶 caspase）的激活密切相关［3］，caspase-3可引起肌动蛋白和肌球蛋白释放，诱导膈肌无力［4］。本实验研究内毒素血症大鼠膈肌iNOS活性和细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表达的变化，探讨内毒素血症膈肌损伤的细胞凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 药品、主要试剂

沙门氏菌属精制内毒素L-2880购自Sigma公司；总RNA提取试剂（Trizol）购自Invitrogen公司；反转录试剂盒和PCR扩增试剂盒购自Fermentas公司；NOS（分型）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）和蛋白定量检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Bax、Bcl-2和caspase-3引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：βactin（630 bp），上游：5＇-GATGGTG GGTATGGGT CAGAAGGAC-3＇，下游：5＇-GCTCATTGCCGA TAGTGATGACT-3＇；Bax（494 bp），上游：5＇-GGATCGAGCAGAGAGGA TGG-3＇，下游：5＇-TGGTGAGTGA GGCAGTGAGG-3’；Bcl-2（227 bp）上游：5＇-CTGGTGGA CAACATCGCT CTG-3＇，下 游：5＇-GGTCTGCTGACCTCA CTTGTG-3＇；caspase-3（349 bp），上 游：5＇-AAGCC GAAACTCTTCA TC-3＇，下游：5＇-TCAGCA TTGACAC AATACAC-3＇。

1.2 实验动物及模型制备

成年雄性SD大鼠32只，体重为200～250 g，清洁级，由蚌埠医学院实验动物中心提供。随机分成4组（n＝8）：生理盐水对照组和内毒素24 h组，48 h组，96 h组，即内毒素腹腔注射12 mg／kg，分别于注射内毒素后 24 h、48 h、96 h处死大鼠［5］，处死前称量各组大鼠体重。

1.3 膈肌标本的采集

水合氯醛麻醉后断头处死大鼠，速取膈肌并称重，计算膈肌重／体重比。在冰生理盐水漂洗后秤膈肌100 mg，液氮冻存后-80℃低温冰箱保存行 RTPCR检测备用，剩余部分-80℃低温冰箱保存生化指标检测备用。

1.4 膈肌组织iNOS、cNOS和SDH检测

取膈肌组织制成10%的组织匀浆，分别检测i-NOS、cNOS和SDH活性，严格按试剂盒说明书操作。

1.5 RT-PCR检测 Bcl-2、Bax和 caspase-3 mRNA的表达

取100 mg膈肌组织，采用Trizol一步法提取组织总RNA 3μg为模板，随机引物逆转录合成cDNA。一次 cDNA 1.5μl为模板 PCR扩增。扩增条件：95℃预变性 3 min后，以（1）95℃ 50 s变性；（2）βactin退火温度59.5℃，50 s；Bcl-2退火温度 61.7℃，50 s；Bax退火温度 62.3℃，50 s；Caspase-3退火温度55.6℃，50 s；（3）72℃ 60 s，反应 30个循环。取 5μl扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色。GIS凝胶处理系统拍摄记录，使用图像分析软件对条带进行光密度扫描做半定量分析，以目的基因与内参对照的积分吸光度比值（Bcl-2／β-actin；Bax／βactin；caspase-3／β-actin）表示 mRNA相对表达量。

1.6 统计分析

实验数据以均数±标准差（±s）表示。应用SPSS 16.0统计软件处理数据，各组采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，并用 Newman-Keuls检验进行组间比较。

2 结果

2.1 大鼠体重和膈肌重／体重比

与正常对照组比较，内毒素血症大鼠96 h组体重和膈肌重／体重比值明显降低（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Body weight and diaphragm／body weight ratio of rats（±s，n＝8）

Tab.1 Body weight and diaphragm／body weight ratio of rats（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Body weight（g）Diaphragm weight／body weight（×10-3）Control 286.86±11.00 3.20±0.22 Endotoxin 24 h 285.63±12.66 3.22±0.22 Endotoxin 48 h 275.63±7.76 3.13±0.14 Endotoxin 96 h 253.13±7.99** 2.93±0.23*

2.2 膈肌组织NOS和SDH活性变化

与正常对照组比较，内毒素血症大鼠膈肌cNOS和iNOS活性明显增强，48 h、96 h组较24 h组明显升高（P＜0.01），24 h组较正常对照组显著升高（P＜0.01）；内毒素血症96 h和48 h组 SDH活性明显降低，96 h组较24 h组降低明显（P＜0.05），24 h组与正常对照组无明显差别（表2）。

Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

cNOS：Constitutive nitric oxide synthase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；SDH：Succinate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs endotoxin 24 h；△△P＜0.01 vs endotoxin 48 h

G r o u p c N O S（U／m g p r o）i N O S（U／m g p r o）S D H（U／m g p r o·m i n ）C o n t r o l 0.1 2±0.0 5 0.0 2±0.0 1 8.1 6±0.2 8 E n d o t o x i n 2 4 h 0.3 6±0.0 4** 0.2 1±0.0 5** 7.8 5±0.2 9 E n d o t o x i n 4 8 h 0.6 1±0.1 0**＃＃ 0.4 0±0.0 5**＃＃ 7.5 8±0.5 0*E n d o t o x i n 9 6 h 0.7 9±0.1 1**＃＃△△ 0.6 4±0.1 3**＃＃△△ 7.3 2±0.3 8**＃

2.3 膈肌组织Bcl-2、Bax和caspase-3的变化

与正常对照组比较，内毒素血症大鼠膈肌Bax mRNA的表达显著升高，内毒素48 h、96 h组较24 h组明显升高，且96 h组较48 h组明显升高；Bcl-2mRNA的表达及Bcl-2／Bax mRNA比值明显降低，48 h、96 h组较24 h组有明显降低，且96 h组较48 h组明显降低（P＜0.01，图 1A和图 1B，表 3）；caspase-3 mRNA表达显著增强，48 h、96 h组较24 h组明显增强，且 96 h组较48 h组明显增强（P＜0.01，图 1，表 3）。

Fig.1 Changes of Bcl-2（A），Bax（B）and caspase-3（C）mRNA expressions of diaphragm tissue in rats

3 讨论

内源性一氧化氮主要是由NOS催化L-精氨酸生成。NOS主要包括三种：iNOS、内皮型 NOS（endothelial NOS，eNOS）和神经型 NOS（neuronal NOS，nNOS）。其中 eNOS与 nNOS合称为结构型 NOS（cNOS）。正常生理情况下，iNOS基因不表达，只有在内毒素和某些细胞因子的刺激下才能产生和表达，并在辅助因子和还原型辅酶Ⅱ的作用下生成大量一氧化氮（nitric oxide，NO）。脂多糖诱导的败血症休克大鼠模型，直接呈休克晚期症状，总NOS、iNOS和 cNOS表达增加［6］，内毒素血症大鼠膈肌以cNOS为主要构型，iNOS显著激活，但NO途径可能不参与内毒素血症膈肌肌浆网释放Ca2＋障碍［1］，也不调控神经肌肉接头的信息传递，在膈肌收缩功能障碍中不发挥重要作用［2］。经 iNOS产生的NO发挥毒性作用，高浓度的NO在体内形成ONOO-，破坏线粒体结构的完整性，诱导线粒体膜通道开放，释放出细胞色素 C，引起 caspase的激活［7］，同时还可上调肿瘤抑制蛋白p53，后者可上调促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白 Bcl-2［8］，Bcl-2／Bax的比值影响细胞凋亡的发生。Bax可以导致凋亡促进因子从线粒体中被释放、下游caspase被活化和线粒体功能丧失，促进细胞发生凋亡［9］。目前 caspase-3是公认的凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多条凋亡途径的共同下游效应部分，与多种细胞发生凋亡变化有密切关系。Caspase-3既是一种最重要的执行酶，同时也是凋亡发生的标志酶。脂多糖干预的大鼠心脏Bcl-2表达下降，Bax表达进一步增加，Bcl-2／Bax比值下降，随干预的时间延长，器官受损程度逐渐加重，细胞凋亡增加［10］。大鼠腹腔注射内毒素96 h后caspase-3活性显著增强，激活经caspase介导的膈肌无力［5］。SDH是所有需氧的细胞线粒体三羧酸循环（糖代谢途径）酶系中的一种脱氢酶，即线粒体标志酶和三羧酸循环的限速酶。

本实验中检测到：内毒素血症大鼠96 h组膈肌质量和SDH活性明显降低，说明膈肌萎缩和线粒体损伤；膈肌组织iNOS活性明显增强，并随干预时间的延长，激活明显增强；Bax和caspase-3 mRNA表达显著增加，Bcl-2 mRNA表达和 Bcl-2／Bax比值明显降低，并随着干预的时间延长，变化明显加剧，提示Bcl-2抑制凋亡的作用明显降低，Bax促凋亡作用增强，激活caspase-3，导致膈肌细胞凋亡，随着干预时间的延长，促凋亡的作用加强，启动膈肌细胞凋亡，促成膈肌萎缩。

Tab.3 Expressions of Bcl-2，Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

Tab.3 Expressions of Bcl-2，Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs endotoxin 24 h；△△P＜0.01 vs endotoxin 48 h

Group Bcl-2／β-actin Bax／β-actin Bcl-2／Bax Caspase-3／β-actin Control 0.88±0.04 0.49±0.06 1.18±0.26 0.14±0.01 Endotoxin 24 h 0.78±0.02** 0.68±0.07** 1.17±0.15** 0.29±0.03**Endotoxin 48 h 0.58±0.05**＃＃ 0.84±0.12**＃＃ 0.71±0.10**＃＃ 0.42±0.03**＃＃Endotoxin 96 h 0.47±0.03**＃＃△△ 1.07±0.12**＃＃△△ 0.44±0.05**＃＃△△ 0.54±0.05**＃＃△△

综上所述，内毒素血症大鼠随病程的延长，膈肌组织iNOS活性显著增强，诱导产生NO的毒性作用损伤线粒体，上调促凋亡基因Bax和下调抑凋亡基因Bcl-2，启动经caspase-3的细胞凋亡途径，导致膈肌损伤和萎缩。

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