TLR2和TLR4在慢性鼻窦炎鼻息肉中的表达及临床意义

顾兆伟，曹志伟，王韫秀

(中国医科大学附属盛京医院1.耳鼻咽喉科；2.血液研究室，辽宁沈阳 1 10022)

慢性鼻窦炎是常见的慢性疾病之一，多因急性鼻窦炎反复发作未彻底治愈而迁延所致。目前许多观点认为血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子-α等［1-2］因子的产生是由于在炎症刺激下，病原相关性分子模式能够直接被模式识别受体如Toll样受体识别，进而激活细胞内信号传导途径，产生多种能扩大炎症反应和增强杀菌作用的细胞因子。其中Toll样受体就是一类重要的模式识别受体，是最古老最保守的蛋白家族，可识别侵入体内的病原体进而激活免疫细胞应答。Toll样受体的配体大多为病原微生物细胞壁成分，其中Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)识别的配体范围较广，包括革兰氏阳性菌及其胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸、分支菌属的阿拉伯甘露糖脂、螺旋体及支原体等［3］。Toll样受体 4(toll-like receptor 4，TLR4)的配体则主要为革兰氏阴性菌的脂多糖［4］。TLR2和TLR4的配体已经涵盖了自然界绝大多数对人体致病的微生物类别，两者在人类Toll样受体家族中最为重要。

因此，在鼻窦炎的发病因素中，鼻腔黏膜上皮细胞的免疫功能对疾病治疗的转归起着至关重要的作用。目前，TLR2、TLR4在鼻息肉患者鼻腔黏膜中的表达及作用机制的研究报道少见，且存在争议。本研究拟通过对慢性鼻窦炎和鼻息肉标本中 TLR2、TLR4的检测，探讨其在鼻窦炎鼻息肉中的状态及作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象及材料

收集2008年2月～2009年2月住院的慢性鼻窦炎鼻息肉患者62例。根据1997年海口标准［5］，并结合病史、鼻内镜检查及鼻窦 CT扫描进行临床分类。Ⅰ型1期5例，Ⅰ型2期9例，Ⅰ型3期 4例;Ⅱ型1期 4例，Ⅱ型2期11例，Ⅱ型3期15例;Ⅲ型14例。其中Ⅰ型取自炎性黏膜，Ⅱ型和Ⅲ型均取自息肉组织。对照组为5例单纯筛窦骨瘤患者手术切除之筛窦正常黏膜。所有标本均经4%甲醛固定、石蜡包埋并制成4 μm厚切片。其中一张行HE染色验证原病理诊断。所有患者均无变应性鼻炎、支气管哮喘、阿司匹林耐受不良和其他严重疾患。

1.2 研究方法

采用免疫组化SABC法。石蜡切片常规脱蜡、水化，抗原修复，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，分别滴加兔抗人 TLR2、TLR4多克隆抗体，工作浓度为1∶160。TLR2、TLR4多克隆抗体，SABC检验试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。按试剂盒说明行免疫组织化学染色，以细胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。免疫组化切片每张任选10个高倍视野(×400)相机拍照后输入计算机存储，以IPP6.0图像分析软件进行图像分析处理，计算累计光密度值。

1.3 统计方法

计量资料用¯x±s表示，各组均数间的差异用SPSS 13.0软件进行方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR2、TLR4免疫反应

TLR2、TLR4免疫反应阳性的表达为细胞的细胞浆和细胞膜呈黄褐色。其主要表达在鼻腔黏膜上皮细胞、固有层炎性细胞及黏膜下层腺体的胞浆和胞膜上，见图1，2。

2.2 TLR2在各组的表达

如表1，图3，4所示，各组鼻腔黏膜组织中均有TLR2的表达。各型各期均较对照组高，并且随着分型的升高其表达也随之增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);但Ⅰ型和Ⅱ型各期之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1TLR2在各组中的表达(¯x±s)

2.3 TLR4在各组中的表达结果

图1 鼻腔黏膜上皮细胞中TLR4呈阳性染色(SABC ×400)

图4 CRS海口标准分型分期中TLR2的表达

图5 海口标准分型中TLR4的表达

图2 鼻腔黏膜下层腺体细胞中TLR2呈阳性染色(SABC ×400)

图3 海口标准分型中TLR2的表达

图6 CRS海口标准分型分期中TLR4的表达

表2，图5，6所示，各组鼻腔黏膜组织中均有TLR4的表达。各型各期均较对照组高，并且随着分型的升高其表达也随之增加，差异具有统计学意义(P＜0.01);但慢性鼻-鼻窦炎(CRS)Ⅰ型和Ⅱ型各期比较(除Ⅰ型1期与3期之间)差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2TLR4在各组中的表达(¯x±s)

3 讨论

鼻炎、鼻窦炎及鼻息肉是耳鼻咽喉科常见疾病，其发病机理复杂，过去认为三者是相对独立的疾病。但随着研究的深入，炎症反应作为其共同的病因得到越来越多的认同。尽管目前还没有广泛的证据表明鼻炎、鼻窦炎、鼻息肉之间有渐进性的演变，但三者的密切关系是客观存在的。

已有研究显示鼻窦炎、鼻息肉患者均同时患有鼻炎［6］;同时对部分长时间未得到有效治疗的鼻窦炎患者反复进行鼻内镜检查时发现，随着病程的延长，某些患者窦口鼻道复合体处出现了息肉样变;鼻窦炎患者行内镜手术时也常常发现息肉的存在;而对鼻息肉患者进行相关影像学检查时发现其均有鼻窦炎的伴随现象;在术后复发的鼻窦炎患者中也表现出息肉与鼻窦炎症共存的现象。

近年来，随着研究的深入，越来越多的实验证实了TLR在炎症反应中的重要作用，其中TLR与下呼吸道炎症反应密切相关，但其在上呼吸道炎症及鼻炎中的作用研究较少［7］。

TLR是存在于细胞膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，其结构分为胞外片段、跨膜片段及胞内片段3部分［8］。胞外片段是由富含亮氨酸的重复片段间断组成，胞内片段含有IL-1/TLR家族的同源序列，称为Toll同系区域，它是向下游进行信号传导的核心元件，可能与IL-1受体的胞内信号传递过程相似［9］。

自Medzhitov等［8］发现 TLR以来，已发现至少10个成员［10］，其中 TLR2识别的配体范围较广，包括革兰氏阳性菌及其胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸，分支菌属的阿拉伯甘露糖脂等［3］。TLR4的配体则主要为革兰氏阴性菌的脂多糖［4］。这一类物质为多种微生物所共有的一类分子结构，称之为病原相关性分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。至今发现的TLR的配体大多数都属于PAMPs，并且TLR2、TLR4的配体已经涵盖了自然界绝大多数对人体致病的微生物类别，二者在人类TLR家族中最为重要。

目前，TLR2、TLR4在鼻窦炎鼻息肉中的表达存在争议，Wang等［11］在对鼻息肉上皮细胞研究时发现，TLR2和TLR4在细胞表面和细胞内呈现低表达。Claeys等［12］研究结果提示鼻窦炎和正常下鼻甲组织的TLR2、TLR4 mRNA表达水平无明显差异。而 Dong［13］、王成硕等［14-15］学者均采用原位杂交的方法检测TLR2和TLR4在鼻窦炎鼻息肉中的表达时发现，在鼻上皮细胞中有TLR2和TLR4 mRNA的表达，试验组明显高于对照组，并且在感染条件下，其表达均上调。TLR2和TLR4在鼻窦炎鼻息肉中高表达，表明感染性因素仍然是鼻窦炎鼻息肉发生中的重要因素。但并没有研究鼻窦炎鼻息肉分型之间是否存在表达差异。游学俊等［16］采用反转录聚合酶链式反应和免疫组织化学技术分别检测鼻窦炎鼻息肉中TLR2和TLR4的表达，发现鼻窦炎中TLR2 mRNA及蛋白和TLR4 mRNA表达水平高于鼻息肉和下鼻甲组织。鼻息肉组织中TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表达水平与下鼻甲组织相比差异无统计学意义。

本实验采用免疫组织化学技术检测TLR2、TLR4在鼻窦炎鼻息肉中的表达。结果发现TLR2、TLR4在鼻窦炎鼻息肉以及正常筛窦黏膜均有表达，这与既往的报道相吻合［14-18］，表明鼻黏膜上皮有TLR蛋白行使功能。并且发现其在鼻黏膜上皮和腺体细胞以及炎性细胞胞浆、胞膜上表达，提示一旦病原微生物侵袭鼻黏膜上皮，TLR可以直接接触并识别病原相关分子模式，诱发信号传递途径。

笔者首次根据海口分型标准发现 TLR2、TLR4在慢性鼻窦炎鼻息肉Ⅰ～Ⅲ各型中表达量均较对照组明显升高，并在各型中呈现递增趋势，除了Ⅰ型1期与3期之间TLR4的表达具有差异外(可能由于样本量较少等因素造成的)，其它 Ⅰ型和Ⅱ型各期别之间差异无统计学意义。

海口分型标准实际上大体反映了炎症反应的严重程度，TLR2、TLR4表达水平与炎症程度呈正相关。可能提示随着炎症及息肉样变的加重，窦口鼻道复合体阻塞加重，反过来进一步引起炎症的加重，如此恶性循环的后果导致鼻窦炎鼻息肉的渐变过程，鼻炎-鼻窦炎-鼻息肉只是炎症的不同阶段及某些其他因素(如变态反应、解剖结构的异常)的不同表现结果，当然还需进一步的实验证实。

本实验采用免疫组织化学方法检测了鼻窦炎鼻息肉中TLR2、TLR4的蛋白表达水平，尚需在转录水平进一步证实TLR表达量的变化。关于TLR在鼻窦炎鼻息肉发生中的确切调控机制，仍需深入研究证实。这将为阐明鼻窦炎鼻息肉发生发展的分子生物学机制起到重要作用，并为新型免疫制剂的靶向开发提供新思路。

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