骨碎补多指标成分指纹图谱控制与药材质量

高厚明 熊明玲 刘凯南 刘志承 刘纪青

（广州中医药大学附属深圳市中医院药学部，深圳518033）

骨碎补多指标成分指纹图谱控制与药材质量

高厚明 熊明玲 刘凯南 刘志承 刘纪青

（广州中医药大学附属深圳市中医院药学部，深圳518033）

目的 建立骨碎补药材多指标成分的HPLC指纹图谱控制其药材质量。方法采用HPLC-DAD法色谱柱为phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.4%冰醋酸水溶液，梯度洗脱，柱温25℃，流速1.0ml·min-1，检测波长254nm。以抽皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸，3种对照品为参照物，建立骨碎补药材的指纹图谱。结果初步建立了骨碎补药材的HPLC指纹图谱，标定8个共有峰，测定10批骨碎补正品中3种成分含量，抽皮苷0.56%～0.96%，新北美圣草苷0.41%～0.69%，E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸0.11%～0.36%，鉴别了真伪骨碎补。结论利用多指标成分HPLC指纹图谱可从定性和定量两方面控制骨碎补药材的内在质量，指纹图谱的多成分评价方法优于常规的单一指标评价方法。

骨碎补；对照品；高效液相指纹图谱；多指标成分；鉴别

骨碎补为中药材水龙骨科植物槲蕨Dryanria fortunei（Kunze）JSm的干燥根茎。其化学成分主要有黄酮类、挥发油和萜类化合物等。《中国药典》［1］原来以其主要的黄酮类化合物柚皮苷（naringin）作为质量控制的唯一指标。现代研究表明：多指标成分分析能更全面反映中药（如骨碎补等）整体质量信息［2］。笔者以抽皮苷、新北美圣草苷及E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸多指标成分为对照品，建立多指标成分指纹图谱鉴定市售骨碎补药材的真假优劣。

1 仪器与试药

Agilent 1100 HPLC仪，包括四元梯度泵，DAD紫外检测器及Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱（美国Agilent公司）。

柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110722-201002），新北美圣草苷，E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸（沈阳药科大学药学院提供，纯度98%以上），甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇、冰醋酸、水等为分析纯。10批骨碎补正品（详见表1），经广州中医药大学中药学院张丹雁教授鉴定为正品，广州市药材市场购买五批骨碎补药材。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：phenomenex C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）和0.4%冰醋酸水溶液（B）：二元梯度洗脱程序：0～10min，5%A～10%A，10～25min，10%A～22%A；30～40min，22%A～70%A，柱温：25℃，流速1.0ml·min-1，检测波长：254nm，进样量：20μl。

2.2 对照品溶液的制备分别精密称取干燥恒重的抽皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸适量，分别用甲醇制成质量浓度分别为2.52、1.096、0.520g·L-1的对照品溶液。同时另外称取3种对照品配制成同单独对照品溶液相同浓度的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密称取骨碎补药材细粉1.0g（10批样品分别称定），置园底烧瓶中，分别加入30倍的50%甲醇，分别回流1h，用0.45μm微孔滤膜过滤，用50%甲醇配制成50ml备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 对照试验分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入HPLC仪记录40min内的色谱峰，见图1，高效液相色谱图，可见骨碎补供试品在对照品S1、S2和S3均有相应色谱峰。

图1 高效液相色谱图

2.4.2 参照物的确定骨碎补药材高效液相色谱图的三个对照品中出峰依次为S1（柚皮苷）、S2（新北美圣草苷）、S3（E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸），综合考虑出峰时间，峰面积和分离度等因素，柚皮苷的含量最高（即峰面积最大），色谱峰分离度较好且纯度高，把它作为参照物即S1，其他峰面积、出峰时间均以S1为1作参照计算。

2.4.3 精密度、重复性与稳定性试验分别依法进行相关试验，结果各共有峰相对保留时间的RSD，相对峰面积的RSD均分别在0.00%～0.57%、0.02%～2.01%（n＝6），各共有峰的相似度均分别在0.998～1（n＝6）。

2.5 各样品中主成分含量测定

2.5.1 工作曲线的制定分别精密吸取“2.2”项的柚皮苷、新北美圣草苷及E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸的对照品溶液适量，每一对照品均用甲醇稀释成10ml，成为6个系统浓度的标准溶液，分别取样20μl进HPLC仪测定，分别以柚皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸的峰面积为纵坐标（y），其质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程，分别为YS1＝9.02× 103XS1-13.3（rs1＝0.9958），YS2＝8.19×103XS2-0.789（rs2＝0.9987），YS3＝2.60×103XS3-1.96（rs3＝0.9966）。经总结柚皮苷、新北美圣草苷和E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸的质量浓度分别在25.2～504mg·L-1，22.0～384mg· L-1和10.4～208mg·L-1范围内均呈良好的线性关系。

2.5.2 样品含量测定分别精密吸取上述对照品溶液和上述10批样品供试品溶液各20μl，分别注入HPLC仪测定其各自峰面积计算即得。见表1。

表1 10批不同来源骨碎补药材中3种成分的含量（n，%）

2.6 多指标成分指纹图谱的构建

2.6.1 共有指纹峰的标定按照“常用中药材HPLC指纹图谱测定技术”［3］和《中药注射剂指纹图谱研究技术要求》，以柚皮苷为参照物（S1），分别计算10批骨碎补样品指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和峰面积，详见表2。

表2 共有峰相对保留时间和相对峰面积平均值及RSD（%）

因此标定它们为共有指纹峰详见图2及图1，图中8个色谱峰为槲蕨所共有，这就作为定性定量鉴别检测骨碎补的依据。

图2 10批骨碎补药材的全波长HPLC二维指纹图谱

2.6.2 共有指效峰的相似度计算评价用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对10批骨碎补指纹图谱（见图2）进行评价，其相似度计算结果。

10批样品中其相似度由0.978～0.999，平均为0.988。

2.7 广州市药材市场购买五批不同产地骨碎补的鉴别将广州市购买的湖南、山东、四川、广西、山西产的骨碎补样品各取1.0g细粉，按照“2.3”项方法制备供试品液，按“2.1”色谱条件进样测定，其指纹图谱见图3。

图3 不同产地的市售骨碎补的高效液相指纹图谱

3 讨论

中药指纹图谱是一种用综合、宏观、非线性的分析观念和质控模式，全面表现中药组成特征和质量分析的新技术，现已成为国际认同提倡并推行的中药质量评价手段［4］。本文建立了骨碎补中药材3个指标成分的HPLC指纹图谱与文献［6］指纹图谱一致，均具有8个共有指纹峰，经对照品比较确定8号峰为柚皮苷（S1），7号峰为新北美圣草苷（S2），2号峰为E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸（S3），其他1、3、4、5、6为其有效化学成分，具体化学物名有待进一步确认。

用这骨碎补3指标成分的指纹图谱鉴定广州市药材市场购买的五批骨碎补，其中A（湖南）、B（山东）、C（四川）产的骨碎补指纹图谱的共有指纹峰数不符，或其各指纹峰相对保留时间和相对峰面积无法与本研究的指纹图谱匹配，更无法评价其相似度（见图2、图3），被认定为非正品。其中D（广西）和E（山西）产骨碎补共有指纹峰中有8个可匹配，且相似度＞0.9，这8个共有指纹峰的相对保留时间和峰面积与本法建立的指纹图谱一致，被认定为正品。其中D的抽皮苷含量0.71%，新北美圣草苷0.52%，E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸0.23%，即3个指标成分含量共为1.46%，而E的S1、S2和S3分别为0.59%，0.33%和0.25%，3个指标成分含量为1.17%，可见，广西产骨碎补质量比山西的优。我国骨碎补正品为槲蕨（Drynariae），非正品有9种之多［5］，若不认真鉴别选择，将会事与愿违。

《中国药典》前期［1］骨碎补中药提取物质量研究均以抽皮苷为唯一对照品，笔者2011年骨碎补HPLC指纹图谱以柚皮苷、新北美圣草苷为双对照品［5］，本研究增加E-4-0-β-D葡萄糖酰咖啡酸成为多指标成分对照研究，信息更全面，图谱更优质。

现代研究认为：多指标定量指纹图谱具有数据全面、图谱质优与化学计量学紧密结合等特征和优点，能对中药复杂系统更全面反映整体质量，其在质量控制领域中具有极好的应用前景［2，4］。本研究中骨碎补8个共有峰，还有5个为未知化学成分，如若能研究知晓并提纯，再作增加对照品的多指标成分指纹图谱的研究，像Feng C那样把中成药益宫胶囊（YIGONG Capsule）中的10种活性成分都分离测定，其结果将更具实用价值。看来，建立多指标成分分析法对中药材，中药制剂的质量控制其意义重大［6］。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．北京：化学工业出版社，2005：179-180．

［2］雷利利，张熙洁，侯林中．现代色谱技术在中药制剂多指标成分质量控制中的应用［J］．中国药房，2011，22（39）：3733-3735．

［3］蔡宝昌，刘训红．常用中药材HPLC指纹图谱测定技术［M］．北京：化学工业出版社，2005：22-25．

［4］Liang XM．Jin Y．wang YP．et al．Qualitative and quantitative analysis in quality control of traditional Chinese Medicine［J］．Jchromatogr A，2009，1216（11）：2033．

［5］熊明玲，刘凯南，高厚明，等．骨碎补高效液相指纹图谱的构建与应用［J］．中国药业，2011，20（5）：4-6．

［6］徐金钟，邢丽红，王书芳，等．HPLC-UV定量分析清热灵颗粒中的5个成分［J］．中国药学杂志，2010，45（2）：147．

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.116

：1672-2779（2013）-23-0158-02

苏 玲

2013-10-11）