电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经生长相关蛋白-43和Nogo-A表达的影响①

韩永升，韩咏竹，徐磊，刘向国，徐银

电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经生长相关蛋白-43和Nogo-A表达的影响①

韩永升1，韩咏竹1，徐磊2，刘向国3，徐银1

目的探讨电针对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠神经功能恢复和脑组织神经生长相关蛋白-43(GAP-43)、Nogo-A表达的影响。方法48只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组、模型组和电针组，每组16只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。电针组于造模成功90 min后电针刺双侧内关、水沟、三阴交和百会30 min，每天1次。假手术组和模型组不进行任何干预治疗。各组大鼠在造模后7 d、14 d各取8只进行神经功能评估及免疫组化SP法观察脑组织GAP-43、Nogo-A的表达。结果假手术组大鼠无神经功能缺损症状；7 d时，模型组和电针组神经功能评分无显著性差异(P＞0.05)，14 d时，电针组神经功能优于模型组(P＜0.05)。假手术组各时间点未见GAP-43阳性细胞表达。7 d时，模型组缺血灶周围脑组织出现GAP-43阳性细胞，14 d时减少；电针组GAP-43阳性细胞各时间点较模型组明显增加(P＜0.01)。假手术组仅见少量Nogo-A表达，模型组脑缺血区7 d、14 d时Nogo-A表达明显增多(P＜0.01)，电针组Nogo-A表达在各时间点较模型组明显减少(P＜0.01)。结论电针能通过促进局灶性脑梗死大鼠脑组织内GAP-43表达、抑制Nogo-A表达，改善大鼠的神经功能。

缺血/再灌注；电针；神经功能；神经生长相关蛋白-43；Nogo-A；大鼠

[本文著录格式]韩永升，韩咏竹，徐磊，等.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经生长相关蛋白-43和Nogo-A表达的影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(2):119-123.

缺血性脑血管病(ischemic cerebral vascular disease,ICVD)是指因脑血液供应障碍引起局部脑组织缺血、缺氧导致的坏死或软化，由于发病率、患病率、死亡率、致残率和复发率高，已成为威胁人类健康的重大疾病[1]。目前，关于ICVD的治疗仅组织型纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator,t-PA)有循证医学证据证明有效，但临床只有3%～5%的急性缺血性脑卒中患者得到t-PA治疗；神经保护是缺血性脑卒中的常用治疗方法之一，但效果甚微[2-3]。传统针刺疗法治疗缺血性脑血管病在临床中应用广泛，其中“醒脑开窍”针刺疗法，经近万例的临床实践，总有效率达98.56%[4]。

神经生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)对神经的生长、发育、再生以及突触功能的维持和递质的释放都起着重要作用，是神经再塑、再生的分子标志物[5]。Nogo-A是一种神经轴突生长相关蛋白，与中枢神经再生的关系最为密切，广泛表达于中枢神经系统中，在抑制神经轴突再生表达过程中起重要作用。当神经组织受损发生重建时，Nogo-A的表达可再次增强[6-8]。本研究观察电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中GAP-43和Nogo-A表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重250～280 g，由上海西普尔-必凯实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)2008-0016。常规饲养，预适应环境1周后进行实验。

1.1.2主要仪器和试剂G6805电针仪：上海医疗用品厂有限公司；德国LEICA RM2016轮转式切片机：上海徕卡仪器有限公司；日本Olympus BX51显微镜：日本Olympus光学工业株式会社；免疫组化试剂盒SP-9000：北京中杉金桥生物技术有限公司；GAP-43抗体、Nogo-A抗体：北京博奥森生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组大鼠随机数字法分为假手术组、模型组、电针组，每组16只。

1.2.2造模参考Longa[9]方法并加以改进。大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉。切开右侧颈部，逐层分离暴露右颈总动脉，结扎翼腭动脉和颈外动脉，将预先制备好的末端圆钝、直径约0.25～0.28 mm尼龙线经颈总动脉插入约18～20 mm至大脑中动脉近端，阻断大脑中动脉血供120 min后，拔出尼龙线。假手术组只分离动脉，不结扎、插线。大鼠苏醒后参照Longa[9]方法评分：0分：未见神经病学征象，无神经功能缺损症状；1分：大鼠被提尾倒悬时，病灶右侧前肢屈曲、抬高，不能伸展右侧前爪；2分：行走时对侧旋转转圈；3分：行走困难并向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平呈下降状态。达到1～3分为造模成功，采用差额补充的方法补足每组的实验动物数。

1.2.3电针干预电针组于造模成功后用自制鼠夹固定，不麻醉。根据华兴邦等制定的大鼠针灸穴位图谱[10]，选双侧内关、水沟、双侧三阴交、百会，用华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司)，直径0.2 mm，针身0.25～0.5寸，直刺双侧内关1 mm至筋间，鼻中隔下向上斜刺水沟1 mm，直刺三阴交5 mm，向前或向后斜刺百会2 mm，留针30 min；留针期间将内关、三阴交穴针柄分别连接G6805电针仪，施以疏密波，频率2/100 Hz，电压2～4 V，强度逐渐加大到大鼠针刺部位轻微抖动。首次针刺在动物造模成功后90 min进行，其后每天上午针刺1次。模型组和假手术组常规饲养于笼内，不进行任何干预。

1.3观察指标

1.3.1神经功能评定参照Longa神经功能评分标准评分[9]，于造模后7 d、14 d分别进行神经功能评分。

1.3.2免疫组织化学染色各组大鼠分别于造模后7 d、14 d随机取8只。10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于手术台，剪开胸腔，仔细剪开心包膜，暴露心脏，在心尖处剪一小切口，用9号针头插入左心室，灌注生理盐水，待右心耳膨起，剪开右心耳让血液流出；至右心耳流出液无色透明时，改用4%多聚甲醛灌注固定。立即开颅取脑，在视交叉处切开，冠状切取2 mm厚包含梗死灶区域及左右半球的组织块浸于4%多聚甲醛中。在梗死区取约0.5 mm厚脑组织50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋。连续冠状切片，厚5 μm。

石蜡切片常规脱蜡脱水，浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中，电炉加热至沸腾后断电，间隔5 min后再加热至沸腾，反复2次；冷却至室温后，0.1 mol/L PBS洗涤2次；置3%H2O2去离子水孵育10 min；PBS冲洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清，室温孵育15 min，倾去；分别滴加1∶200的GAP-43、Nogo-A一抗，4℃过夜；PBS冲洗3次，每次3 min；滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加DAB显色试剂，室温显色，显微镜下控制反应时间，显色后，蒸馏水洗涤终止反应。苏木素轻度复染，自来水水洗；1%盐酸酒精稍分色后兰化片刻；常规脱水、透明、中性树胶封片。用正常山羊血清替代一抗作阴性对照。Olympus BX51显微镜观察并摄片，采用JD801形态学图像分析系统对图像进行分析。

1.4统计学分析

2 结果

2.1神经功能评分

假手术组大鼠无神经功能缺损症状。模型组和电针组比较，造模后7 d，神经功能评分无显著性差异(P＞0.05)，14 d时电针组神经功能评分优于模型组(P＜0.05)。见表1。

表1　各组大鼠缺血再灌注后神经功能评分

2.2GAP-43

假手术组中未见GAP-43阳性细胞表达。造模后7 d，模型组脑缺血区出现GAP-43阳性细胞，14 d时减少。电针组在各个时间点GAP-43阳性细胞表达较模型组显著增加(P＜0.001)。见表2、图1。

2.3Nogo-A

假手术组大鼠大脑可见少量Nogo-A表达。造模后7 d，模型组脑缺血区Nogo-A表达增加，14 d时继续增加，与假手术组比较有非常高度显著性差异(P＜0.001)。电针组在各个时间点Nogo-A表达均较模型组显著减少(P＜0.001)。见表3、图2。

表2　各组大鼠脑内GAP-43阳性细胞数比较

表3　各组大鼠脑内Nogo-A阳性细胞数比较

图1　模型组、电针组大鼠脑组织GAP-43免疫组织化学染色(400×)

图2　模型组、电针组大鼠脑组织Nogo-A免疫组织化学染色(400×)

3 讨论

GAP-43是一种膜磷酸蛋白，是再生相关基因(regeneration associated gene,RAG)表达的产物蛋白，它不均匀地存在于脑组织中，在生长、再生的轴突末端含量极高，在指导轴突生长和调控新的轴突连接中发挥重要作用。GAP-43被认为是神经元生长的内在调节因子，可作为神经生长和再生的分子标志物[11]。

在突触重建过程中，新生发芽末梢中GAP-43含量非常高。只要有突触重建，即使无轴突延伸，GAP-43也会高水平表达；一旦突触重建完成，GAP-43及GAP-43 mRNA含量下降，甚至呈微量或无阳性表达。

Nogo是中枢神经系统一种抑制轴突生长的因子，有Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C 3种主要异构体，脑缺血损伤后，能抑制神经锥再生的病理过程，引起神经突起生长锥的崩解[12]。其中Nogo-A与中枢神经再生的关系最为密切，广泛表达于中枢神经系统中，在抑制神经轴突再生表达过程中起重要作用[13]。

GAP-43作为一种载体蛋白的标记物，既促进神经元可塑性再生，又间接抑制Nogo-A表达，从而阻止细胞凋亡，是神经再生表达过程中的一个典型特征，可随损伤的时空表象呈动态表达变化。本研究选取GAP-43和Nogo-A作为神经元标志蛋白进行观察。

针刺法选用石学敏院士创立的“醒脑开窍”针法。临床证实，醒脑开窍针刺法在降低患者的残疾率、减少患者神经功能缺损程度方面疗效确切，对于提高患者日常生活质量有显著意义。“醒脑开窍”针法的主要穴位水沟、内关、三阴交相配可促进脑的代谢和修复，改善大脑的生理功能，达到“醒神开窍”之功。百会穴属督脉，为手足三阳、督脉之汇，具有醒脑开窍、安神定志、升阳举陷的作用，对脑卒中偏瘫患者大脑皮层的中枢生物电有良好的调节作用。本实验选取水沟、内关、三阴交为主穴，百会为配穴。

Zhou等通过不同的参数刺激实验大鼠的水沟穴和百会穴，发现当电针刺激强度为1.0～1.2 mA、刺激频率为5～20 Hz时能够显著恢复缺血性脑梗死，改善神经功能及死亡率，同时能使脑血流量增加100%[15]。王世军等发现，电针刺激内关穴可显著增加脑缺血区微血管数目，并且能减少神经细胞的死亡率[16]。因此本研究选用电针方法以量化针刺强度。

脑缺血时，神经细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤后脑细胞死亡的重要途径之一，是神经功能损害及梗死灶扩大的重要因素。减轻局灶性损伤程度和范围，对抢救半暗带区神经细胞，阻断细胞凋亡的发生、发展尤为重要[17]。相关实验研究显示，脑缺血再灌注2 h后，GAP-43呈基础表达，6～48 h明显增高，7 d达高峰，之后表达逐渐降低，14 d呈最低表达。神经损伤后再生时，轴突内GAP-43的含量可增加20～100倍[18-19]。

成年时，大部分脑区GAP-43表达水平很低；当脑组织损伤时，损伤周围的神经元通过侧支发芽和反应性轴突再生进行功能代偿，这些区域GAP-43水平再次升高，且随着损伤修复时间的延长而逐步回落[20]。本实验结果显示，假手术组未见GAP-43阳性细胞，模型组GAP-43阳性细胞数在缺血7 d、14 d后增多，电针可以促进GAP-43表达，进一步促进大鼠脑缺血损伤区轴突的生长和再生，对损伤神经的恢复有一定效果。

Nogo-A是目前发现作用最为强烈的神经纤维再生抑制物质，在大鼠发育阶段的前脑表达明显；神经发育成熟后，Nogo-A在脑内呈低水平表达。当神经组织受损发生重建时，Nogo-A的表达可再次增强。脑梗死后，Nogo-A的表达增强会使受损神经元的轴突再生受限，损伤后功能恢复不理想。本研究显示，假手术组大鼠脑组织中的Nogo-A处于较低的表达水平，模型组大鼠梗死灶周围Nogo-A在梗死后表达增高，电针可以下调脑梗死灶周围Nogo-A的表达，有效解除神经再生抑制，促进神经元轴突再生，从而促进脑缺血大鼠的运动功能恢复。

电针组大鼠神经功能恢复优于模型组，证实电针内关、水沟、三阴交、百会穴能够促进大鼠脑缺血再灌注后神经功能恢复。其机制可能涉及很多方面，其中上调GAP-43表达，下调Nogo-A表达，从而促进神经再生，增强神经可塑性可能是重要机制之一。

[1]罗祖明,丁新生.缺血性脑血管病学[M].北京:人民卫生出版社,2011:1001.

[2]Taussky P,Tawk RG,Wilson P,et al.Medical therapy for ischemic stroke:review of intravenous and intra-arterial treatment options[J].World Neurosurg,2011,76(6S):S9-S15.

[3]Young AR,Ali C,Duretête A,et al.Neuroprotection and stroke:time for a compromise[J].J Neurochem,2007,103: 1302-1309.

[4]石学敏.“醒脑开窍”针刺法治疗中风病9005例临床研究[J].中医药导报,2005,11(1):3-5.

[5]Benowitz LI,Routtenberg A.GAP-43:an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity[J].Trends Neurosci, 1997,20(2):84-91.

[6]Mingorance-Le Meur A,Zheng B,Soriano E,et al.Involvement of the myelin-associated inhibitor Nogo-A in early cortical development and neuronal maturation[J].Cereb Cortex, 2007,17:2375-2386.

[7]Tsai SY,Markus TM,Andrews EM,et al.Intrathecal treatment with anti-Nogo-A antibody improves functional recovery in adult rats after stroke[J].Exp Brain Res,2007,182:261-266.

[8]Schwab ME,Mir A,Rouiller E,et al.Intrathecally infused antibodies against Nogo-A penetrate the CNS and downregulate the endogenous neurite growth inhibitor Nogo-A[J].Mol Cell Neurosci,2006,32:161-173.

[9]Longa EZ,Weistein PR,Calson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[10]华兴邦,周浩良,李辞荣,等.大鼠穴位图谱的研制[J].实验动物与动物实验,1991,1:1-5.

[11]Denny JB.Molecular mechanisms,biological actions,and neuropharmacologyofthegrowthassociatedprotein GAP-43[J].Curr Neuropharmaeo1,2006,4(4):293-304.

[12]Brittis PA,Flanagan JG.Nogo domains and a Nogo receptor: implications for axon regeneration[J].Neuron,2001,30(1): 1-14.

[13]Niederost B,Oertle T,Fritsche J,et al.Nogo-A and myelin-associated glycoprotein mediate neurite growth inhibition by antagonistic regulation of RhoA and Racl[J].J Neurosci,2002, 22(23):10368-10376.

[14]唐卫东,陈伟,陈红.醒脑开窍针刺法治疗中风后偏瘫的临床疗效观察[J].赣南医学院学报,2009,4(29):570-571.

[15]Zhou F,Guo JC,Cheng JS,et al.Electroacupuncture increased cerebral blood flow and reduced ischemic brain injury: dependence on stimulation intensity and frequency[J].J Appl Physiol,2011,111:1877-1887.

[16]王世军,崔可密,卢岩,等.针刺对MCAO大鼠海马CA3区微血管数目及神经元死亡率的影响[J].山东中医药大学学报, 2005,29(1):59-60.

[17]刘亚军.局灶性脑缺血再灌注细胞凋亡发生机制的研究进展[J].医学综述,2002,8(5):253-254.

[18]Tolner EA,Van Vliet EA,Holtmaat AJ,et al.GAP-43 mRNA and protein expression in the hippocampal and parahippocampal region during the course of epileptogenesis in rats[J].Eur J Neurosci,2003,17(11):2369-2380.

[19]Carrasco J,Penkowa M,Giralt M,et al.Role of metal lothionein2 III following central nervous system damage[J].Neurobiol Dis,2003,13(1):22-36.

[20]Kotulska K,Marcol W,Larysz Brysz M,et al.Impaired regeneration of Bcl-2 lacking peripheral nerves[J].Neurol Res, 2005,27(8):843-849.

Effects of Electroacupuncture on Expression of Growth Associated Protein-43 and Nogo-A after Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

HAN Yong-sheng,HAN Yong-zhu,XU Lei,et al.Institute of Neurology,Anhui Traditional Chinese Medical College,Hefei 230061,Anhui,China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on expression of growth associated protein-43(GAP-43)and Nogo-A in brain after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.Methods48 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group and electroacupuncture group,and the latter two were modeled as middle cerebral artery occlusion and reperfusion with nylon monofilament suture.Electroacupuncture was performed 90 min after modeling in the electroacupucture group at acupoints of Neiguan(PC06),Shuigou(DU26),Sanyinjiao(SP06),Baihui(DU20),for 30 min,once a day.The sham group and the model group were conventionally fed in cages without any intervention.8 rats of each group were assessed with Longa's score,and the expressions of GAP-43 and Nogo-Awere detected with immunohistochemistry 7 d and 14 d after modeling respectively.ResultsThe sham group presented no neurological symptoms.There was not different in Longa's score between the model group and the electroacupuncture group 7 d after modeling(P＞0.05),but was different 14 d after modeling(P＜0.05).GAP-43 positive cells was not found in the sham group,but could be found around cerebral ischemia 7 d after modeling,which decreased 14 d after modeling in the model group.GAP-43 positive cells increased significantly in the electroacupuncture group compared with the model group at each time(P＜0.01).Nogo-A positive cells was few found in the sham group,and was more in the model group(P＜0.01).The expression of Nogo-A decreased significantly in the electroacupuncture group compared with the model group at each time(P＜0.01).ConclusionElectroacupuncture can improve neurological function of focal cerebral ischemia/reperfusion rats,which may be associated with the increase of GAP-43 and descrease of Nogo-Ain peri-infarct regions.

ischemia/reperfusion;electroacupuncture;neurological function;growth associated protein-43;Nogo-A;rats

R743

A

1006-9771(2013)02-0119-05

2012-09-08

2012-10-24)

安徽中医学院临床科学研究基金项目(No.2009LC3-003)。

1.安徽中医学院神经病学研究所附属医院，安徽合肥市230061；2.蚌埠医学院第一附属医院康复医学科，安徽蚌埠市233004；3.安徽中医学院中西医结合临床学院，安徽合肥市230038。作者简介：韩永升(1976-)，男，安徽肥东县人，博士研究生，副主任医师，主要研究方向：神经系统疾病的康复治疗。通讯作者：韩咏竹(1957-)，男，安徽合肥市人，教授、主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：神经遗传病的诊断治疗。曾获安徽省科技进步一等奖，获中华中医药学会科学技术三等奖，上海市科技进步三等奖。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.006