莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠凝血四项的影响①

袁廷伟，孙芳玲，王晓峰，艾厚喜，王文，龚大春

莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠凝血四项的影响①

袁廷伟1,2，孙芳玲2，王晓峰2，艾厚喜2，王文2，龚大春1

目的 研究莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠纤维蛋白原(Fib)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)的影响。方法用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，造模后，分别给予莫诺苷低剂量(30 mg/kg)、中剂量(90 mg/kg)、高剂量(270 mg/kg)连续灌胃7 d，阿司匹林(ASA)为阳性对照药。使用试剂盒分别检测Fib、PT、APTT、TT指标的变化。结果与假手术组相比，模型组Fib含量显著增加(P＜0.001)，PT、APTT、TT显著缩短(P＜0.001)；与模型组相比，莫诺苷能明显降低Fib含量(P＜0.01)，延长PT、APTT、TT(P＜0.05)。结论莫诺苷具有对抗局灶性脑缺血再灌注大鼠凝血功能的作用。

莫诺苷；凝血；缺血/再灌注；大鼠

[本文著录格式]袁廷伟，孙芳玲，王晓峰，等.莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠凝血四项的影响[J].中国康复理论与实践, 2013,19(2):104-106.

脑卒中具有高发病率、高致残率的特点。中国每年新发脑卒中患者约200万人，其中70%～80%的脑卒中患者因为残疾不能独立生活[1]。缺血性脑卒中占脑卒中的80%以上，是由于脑部主要血管短期内出现狭窄或闭塞而导致局部或全脑缺血、缺氧、甚至梗死的一种疾病。缺血性脑卒中具有高死亡率、高复发率和高致残率的特点，严重威胁中老年人的健康和生活质量，并且近年来呈现上升和低龄化的发病趋势。脑缺血后脑微血管发生管径变细、灌注压力降低等血管病变，引起血流动力学异常。高黏度的血液在此情况下易导致脑组织灌注不足、缺氧和代谢障碍，同时引起脑组织血管壁的物理损伤以及血管内皮细胞损伤，容易形成血栓。凝血四项包括纤维蛋白原(fibrinogen, Fib)含量、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶时间(thrombin time,TT)，是判断凝血系统病理变化和指导临床用药的重要指标。莫诺苷是本实验室从中药山茱萸中提取、分离得到的单体化合物。前期研究表明，莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠有神经保护作用[2]。本文旨在探讨莫诺苷对局灶性脑缺血模型大鼠凝血四项的影响，为进一步研究莫诺苷脑保护作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物

莫诺苷：由首都医科大学宣武医院药物研究室从山茱萸中提取制备，为淡黄色粉末，高效液相色谱分析显示纯度为98.5%，蒸馏水溶解成所需浓度药液备用。阿司匹林(acetyl salicylic acid,ASA)：SIGMA公司产品，蒸馏水溶解备用，以0.1 mol/L NaHCO3调pH至7.0左右，再加蒸馏水稀释到所需浓度。

1.2 试剂及仪器

Fib含量测定试剂盒、PT测定试剂盒、TT测定试剂盒和APTT测定试剂盒均为上海太阳生物技术有限公司产品。Microfuge低温离心机：美国Beckman公司。

1.3 动物及模型制备

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，体重260～280 g，平均(260±10)g，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2007-004。

1.3.1 模型制备 参照Longa等[3]所介绍的大脑中动脉线栓模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)制备，并稍加改进。大鼠术前禁食12 h。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌分离肌肉和筋膜，暴露右侧颈总动脉。分离右侧颈外动脉和颈内动脉。于近心端结扎颈总动脉，且在颈总动脉分岔处结扎颈外动脉。动脉夹夹闭颈内动脉，在近心端距颈总动脉分岔约4 mm处用眼科剪剪一斜行细小动脉切口，将直径0.28 mm的栓线从颈总动脉插入颈内动脉约18 mm，此时栓线已进入大脑中动脉，到达大脑前动脉起始部，造成大脑中动脉供血相关区的梗死灶。栓塞30 min后缓慢拔出栓线，实现再灌注。假手术组大鼠除插入栓线深度为10 mm外，其余操作与模型手术组相同。

1.3.2 模型成功评价标准 参照Longa法[3]的5级评分法对实验动物的神经行为学进行评分。0分：无神经系统损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向左侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走，意识丧失。1～3分为造模成功。

1.3.3 分组及给药 随机将动物分为6组，每组6只：假手术组、模型组、ASA组(10 mg/kg)、莫诺苷低、中、高剂量组(30 mg/kg，90 mg/kg，270 mg/kg)。采用灌胃给药途径，每天1次，连续给药7 d。假手术组和模型组给予蒸馏水灌胃。

1.4 大鼠凝血四项的测定

1.4.1 血浆Fib含量测定 取末次给药后完成神经行为学评分的大鼠，用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，收集于3.8%枸橼酸钠抗凝管中，3000 r/min离心10 min，取上清血浆按Fib含量测定试剂盒说明书进行测定。具体为：取待测血浆200 µl，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100µl，测定凝固时间(s)。以不同浓度Fib定值血浆含量(mg/ml)为横坐标，以相应的凝固时间(s)为纵坐标，在双对数坐标系上做标准曲线，待测样本Fib含量可从标准曲线上直接读出，记录Fib含量(mg/ml)。

1.4.2 血浆PT测定 血浆制备同上，取上清血浆按PT测定试剂盒说明书进行测定。取待测血浆100µl，37℃预温3 min，加入37℃预温PT试剂200µl，记录凝固时间(s)，即为PT值。

1.4.3 血浆APTT测定 血浆制备同上，取上清血浆按TT测定试剂盒说明书进行测定。取待测血浆100µl，加入APTT试剂100µl，37℃预温5 min；加入37℃预温0.025 mol/L CaCl2溶液100µl，记录凝固时间(s)，即为APTT值。

1.4.4 血浆TT测定 血浆制备同上，取上清血浆按TT测定试剂盒说明书进行测定。取待测血浆200µl，37℃预温3 min，加入TT试剂100µl，记录凝固时间(s)，即为TT值。

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS 13.0统计学软件进行统计处理，结果以(±s)表示。检验方差齐性后用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)比较组间差异，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

与假手术组相比，模型组大鼠血浆Fib含量显著升高(P＜0.001)，PT、APPT、TT显著缩短(P＜0.001)；与模型组相比，莫诺苷3个剂量组的PT、APTT均显著延长(P＜0.001)，莫诺苷中剂量组和高剂量组Fib含量明显降低(P＜0.01，P＜0.001)，莫诺苷中剂量组和高剂量组的TT延长(P＜0.05，P＜0.001)。见表1。

3 讨论

缺血性脑卒中是脑血管疾病中最常见的高致残率的疾病，主要发病人群为中老年人。伴随着中国老龄人口高峰的到来，积极研究脑卒中的病理生理机制及寻找有效的预防治疗手段具有重要的社会意义和经济价值。

表1 莫诺苷对各组大鼠Fib、PT、APTT、TT的影响

血液流变异常与缺血性脑病具有密切的联系[4]。有研究认为，血液流变和凝血功能的异常所导致的高黏血症和高凝血症是心脑血管疾病的主要病因之一[5]。在缺血性脑病时，机体所处的病理状态会进一步加速血液流变状态的恶化，引起恶性循环[6]。临床上通过监测血液流变学的变化来预测缺血性脑卒中的进展，以及判断药物治疗的效果。因此，观察血液流变学的变化对深入了解缺血性脑血管病的病理状态以及对疾病的诊断、治疗和临床监护有一定的参考价值[7]。

血浆Fib是促进血小板聚集最主要的血液蛋白，引起血液黏度和血液流变学改变；APTT和PT主要反映内源性和外源性凝血系统状况；而TT主要反映Fib转为纤维蛋白的时间。凝血四项能有效反映患者的凝血功能。近年来，肝素、香豆素、希美加群等抗凝药物在临床以及基础研究中取得了一定的发展[8]。但抗凝药研究尚未解决的根本问题是如何使抗凝药物能够区别有害的病理性血栓与生理形成的、起恢复和保持血管完整性作用的止血血栓。

本实验中，我们采用线栓法制作大鼠MCAO模型，较好地模拟了临床缺血性脑血管病的病理过程。通过模型大鼠凝血四项的检测发现，局灶性脑缺血早期凝血功能发生障碍。而莫诺苷能显著延长模型大鼠的APTT、PT和TT，表明莫诺苷能同时抑制内源性及外源性凝血因子的活性，有抗凝血作用。Fib在血小板凝聚过程中起着重要作用。血小板被激活时，其膜上形成Fib受体，通过Fib的连接作用形成血小板聚集体，最终形成血栓。莫诺苷能显著降低Fib的含量，抑制血栓的形成，具有很好的抗凝血作用。

本实验室前期研究发现，莫诺苷具有神经保护作用，并能在体外具有抗血栓形成和抗血小板聚集的作用[9]。提示莫诺苷很有可能是具有多作用靶点、新作用机制的治疗缺血性脑卒中的有效药物。但体内抗凝机制复杂，尤其要求药物能选择性作用于病理性血栓的形成。因此，莫诺苷抗凝血治疗缺血性脑血管病的作用仍需更进一步的研究。

[1]吴兆苏,姚崇华,赵冬.我国人群脑卒中发病率、死亡率的流行病学研究[J].中华流行病学杂志,2003,24(3):236-239.

[2]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rat[J].Brain Res Bull,2010, 83(5):196-201.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

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[5]席玉冰.血液流变学在心脑血管疾病方面的应用价值[J].实用医技杂志,2006,18(3):1405-1406.

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[7]尚人才,刘志萍.老年脑血栓患者血液流变及血脂指标观察[J].中国血液流变学杂志,2000,10(1):61-62.

[8]段云霞,陈小玉,张梓倩,等.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[J].中央民族大学学报,2012,21(2):65-70.

[9]王晓峰,陈乃宏,王文.莫诺苷对家兔血小板聚集的影响[J].中国康复理论与实践,2010,16(11):1029-1030.

Effect of Morroniside on Coagulation in Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

YUAN Ting-wei,SUN Fang-ling,WANG Xiao-feng,et al.China Three-Gorges University,Yichang 443002,Hubei,China

ObjectiveTo investigate the effects of morroniside on fibrinogen(Fib),prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT)and thrombin time(TT)in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.MethodsThe animal model was induced with occlusion of middle cerebral artery(MCAO)with suture embolus,and morroniside was then administered intragastrically at the dose of 30,90 and 270 mg/kg for 7 d.Acetyl salicylic acid was taken as positive control drug.The content of Fib,and PT,APTT and TT were measured withrelated kits.ResultsCompared with the sham-operated group,the concentration of Fib significantly increased(P＜0.001)and PT,APTT and TT significantly shortened in the model group(P＜0.001);however,compared with the model group,morroniside significantly decreased Fib content(P＜0.01)and prolonged PT,APTT and TT(P＜0.05).ConclusionMorroniside can antagonize the coagulation function in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.

morroniside;coagulation;ischemia/reperfusion;rats

R743

A

1006-9771(2013)02-0104-03

2012-11-22

2013-01-09)

1.科技部“十二五”重大创新药专项(No.2012ZX09102-201-016)；2.国家自然科学基金(No.81173575)；3.国家自然科学基金(No. 30740053)；4.北京市自然科学基金(No.7062031)；5.北京市教委科研基地-科技创新平台(No.111219)；6.北京市卫生系统高层次卫生技术人才(No. 2011-3-097)。

1.三峡大学，湖北宜昌市443002；2.首都医科大学宣武医院药物研究室，北京市100053。作者简介：袁廷伟(1987-)，男，湖北宜昌市人，硕士研究生，主要研究方向：神经药理。通讯作者：龚大春。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.002