过表达肌浆网Ca2+-ATP酶对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响①

付治卿，李小鹰，鲁晓春，米亚非，周声安

·基础研究·

过表达肌浆网Ca2+-ATP酶对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响①

付治卿，李小鹰，鲁晓春，米亚非，周声安

目的 研究心肌过表达肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)基因对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响。方法超声心动图检测SERCA2a基因转导对慢性心力衰竭犬心脏收缩功能的影响，放射免疫法测定血管紧张素Ⅱ与心房利钠肽、内皮素-1、肿瘤坏死因子-α、白介素-6等神经内分泌因子。结果SERCA2a基因转导后心力衰竭犬的心脏收缩功能得到改善(P＜0.05)，同时上述神经内分泌因子水平均减低(P＜0.05)。结论SERCA2a过表达能改善心肌收缩功能，阻断神经内分泌系统的恶性循环，可能阻止或逆转心肌重塑。

慢性心力衰竭；肌浆网Ca2+-ATP酶；过表达；神经内分泌系统

[本文著录格式]付治卿，李小鹰，鲁晓春，等.过表达肌浆网Ca2+-ATP酶对慢性心力衰竭犬神经内分泌系统的影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(2):129-131.

离体和小动物在体实验[1-2]显示，通过基因转导的方法增加肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA2a)的表达能够改善衰竭心肌的收缩和舒张功能。我们的前期研究也显示，在慢性心力衰竭犬心肌过表达SERCA2a可明显改善心功能[3]。而慢性心力衰竭存在神经内分泌系统的过度激活，迄今尚未见SERCA2a过表达对神经内分泌系统影响的报道。本研究拟探讨过表达SERCA2a对神经内分泌系统的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和携带SERCA2a基因的重组腺相关病毒购自北京本元正阳基因技术股份有限公司，病毒滴度为1×1012v.g./ml。比格犬由解放军总医院医学实验动物中心提供。

1.2 模型的制备和基因转导

16只犬随机分为对照组、心力衰竭(HF)组、EGFP组和SERCA2a组，每组4只。后三组以快速右心室持续起搏的方法构建慢性心力衰竭犬模型。常规麻醉开胸后暴露心脏，剪开心包，缝制心包吊床，选择前降支和心室左缘之间的左室前壁为注射区域。行网格状注射，每个注射点之间相隔约1 cm，注射深度5 mm，每次注射0.1 ml，分别注射PBS溶液、重组腺相关病毒(Recombinant Adeno Associated Virus,rAAV) 1-EGFP、rAAV1-SERCA2a各1 ml，具体方法参照文献[3]。

1.3 心功能检查

于基因转导30 d停止起搏30 min后，在动物清醒状态下行超声心动图检查评价心脏收缩功能[4]。

1.4 血液学检查

1.4.1 样品的收集 于基因转导30 d时，清晨空腹从股静脉抽取静脉血，进行不同的处理后将得到的血清或血浆，置于-80℃冻存待测。

1.4.2 样品的处理

1.4.2.1 血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ) ①酶抑制剂的配制：按取5 ml静脉血计，每管加0.30 mol/L EDTA-Na250 μl、0.34 mol/L 8-羟基喹啉50 μl、0.32 mol/L二巯基丙醇25 μl。②抽取静脉血后，迅速注入放在冰水浴中冷却的酶抑制剂抗凝管中，摇匀；即刻再放回冰水浴中冷却，待离心时取出。4℃，1000 r/ min离心5 min，分离血浆。此操作在15 min内完成。

1.4.2.2 心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和内皮素-1(endothelin-1,ET-1) ①酶抑制剂的配制：按取4 ml静脉血计，每管加10%EDTA-Na230 μl、抑肽酶40 μl。②抽取静脉血后，注入酶抑制剂抗凝管中，摇匀。4℃，3000 r/min离心10 min，分离血浆。

1.4.2.3 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6) 取静脉血4 ml，注入试管中，室温静置凝固后，分离血清。

1.4.3 样品的检测 所有样品交由解放军总医院科技开发中心放免研究所测定。

1.5 统计学分析

采用SPSS 15.0统计软件进行分析，组间变量比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。显著性水平α＝0.05。

2 结果

2.1 超声心动图

与对照组相比，HF组、EGFP组犬左心房(LA)、左室舒张末内径(LVDd)均增大(P＜0.05)；SERCA2a组LA仍明显增大(P＜0.01)，与HF组、EGFP组相比无显著性差异(P＞0.05)；但LVDd较HF组、EGFP组有缩小的趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。HF组、EGFP组每搏量(SV)、左室射血分数(EF)及缩短分数(FS)较对照组明显降低(P＜0.01)；SERCA2a组SV、EF及FS与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，SV、FS较HF组、EGFP组好转(P＜0.05)，EF较EGFP组好转(P＜0.05)，平均值较EGFP组分别增加94.83%、52.93%和68.6%。见表1。

2.2 犬神经内分泌指标

HF组和EGFP组的所有神经内分泌因子较对照组均增高(P＜0.05)；而SERCA2a组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，除IL-6与HF组无显著性差异(P＞0.05)外，其他神经内分泌因子较HF组、EGFP组降低(P＜0.05)。见表2。

表1 各组犬超声心动图指标的比较

表2 各组犬神经内分泌因子的比较

3 讨论

神经内分泌系统的激活是慢性充血性心力衰竭时机体的一种代偿机制。现已证明心力衰竭患者表现为交感神经系统(SNS)、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)、心钠素(ANP)及血管加压素的激活。长期神经内分泌活性增高不仅抑制心功能、加重血流动力学紊乱，还直接损害心肌、激发心肌细胞肥厚、促进心肌细胞凋亡、心肌重构和心肌纤维化，其相互作用，形成恶性循环。

细胞因子是由各种免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而产生的一类小分子多肽，作为细胞间信号传递系统，这些细胞因子多以旁分泌或自分泌形式，通过与靶细胞表面特异性细胞因子受体结合而发挥生物学效应。许多研究表明，细胞因子活化与心力衰竭的发生发展有关。与慢性心力衰竭有关的细胞因子主要有TNF-α、IL-6等。这些细胞因子作用于心脏，可以促进心肌重塑、加重心肌损伤[5-6]。Wu等的研究也证实，炎性细胞因子通过下调SERCA2a基因表达、减少舒张期钙摄取而引起舒张功能不全[7]。本研究发现HF组和EGFP组的AngⅡ与ANP、TNF-α、IL-6高于对照组，表明上述神经内分泌因子的过度激活共同参与心力衰竭的发生、发展。

有实验证明，心肌转基因过表达SERCA2a可以显著改善心脏的舒缩功能。本研究利用超声心动图检测心力衰竭犬过表达SERCA2a的结果也显示，SERCA2a组犬的SV、EF及FS较HF组、EGFP组好转(P＜0.05)，平均值较EGFP组分别增加94.83%、52.93%和68.6%，而与对照组相比无显著性差异。同时SERCA2a组中，AngⅡ与ANP、TNF-α、IL-6等神经内分泌指标较HF组和EGFP组降低，与对照组相比无显著性差异，表明过表达SERCA2a改善心肌收缩功能后，室壁应力降低，神经内分泌系统的恶性循环被阻断，从而可阻止或逆转心肌重塑。具体机制仍需进一步探讨。

SERCA2a在心肌过表达阻断了全身神经内分泌和细胞因子的恶性循环，使其血清含量显著降低，从而使得心脏收缩功能得到进一步改善。

[1]del Monte F,Harding SE,Schmidt U,et al.Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a[J].Circulation,1999,100 (23):2308-2311.

[2]Muller OJ,Lange M,Rattunde H,et al.Transgenic rat hearts over expressing SERCA2a show improved contractility under baseline conditions and pressure overload[J].Cardiovasc Res, 2003,59(2):380-389.

[3]付治卿,李小鹰,鲁晓春,等.心肌肌浆网Ca2+-ATP酶基因转导改善慢性心力衰竭犬心功能的研究[J].中国病理生理杂志, 2008,24(6):1047-1050.

[4]付治卿,李小鹰,刘涛,等.超声心动图在评估犬慢性心力衰竭模型中的作用[J].心脏杂志,2007,19(5):528-530.

[5]Li W,Olshansky B.Inflammatory cytokines and nitric oxide in heart failure and potential modulation by vagus nerve stimulation[J].Heart Fail Rev,2011,16(2):137-145.

[6]Tamariz L,Hare JM.Inflammatory cytokines in heart failure: roles in aetiology and utility as biomarkers[J].Eur Heart J, 2010,31(7):768-770.

[7]Wu CK,Lee JK,Chiang FT,et al.Plasma levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 are associated with diastolic heart failure through downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase[J].Crit Care Med,2011,39(5):984-992.

Effect of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase Overexpression on Neuroendocrine System in Chronic Heart Failure Beagles

FU Zhi-qing,LI Xiao-ying,LU Xiao-chun,et al.First Department of Geriatric Cardiology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo explore the effect of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase(SERCA2a)overexpression on neuroendocrine system in chronic heart failure beagles.MethodsThe cardiac contraction function of chronic heart failure beagles were assessed by echocardiography before and after SERCA2a gene transduction.Radiation immune method was used to test the serum level of neuroendocrine factors such as AngiotensinⅡ,atrial natriuretic peptide,endothelin-1 and TNF-α,IL-6.ResultsThe cardiac contraction function of chronic heart failure beagles improved greatly(P＜0.05),and the serum levels of neuroendocrine factors significantly reduced after SERCA2a overexpression(P＜0.05).ConclusionThe vicious circle of neuroendocrine system may be blocked partially by SERCA2a overexpression.

chronic heart failure;sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase;overexpression;neuroendocrine system

R541.6

A

1006-9771(2013)02-0129-03

2012-07-20

2012-08-29)

解放军总医院南楼心血管一科，北京市100853。作者简介：付治卿(1977-)，女，山西寿阳县人，博士，主治医师，主要研究方向：慢性心力衰竭的治疗。通讯作者：李小鹰。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.008