土木香中倍半萜内酯抑制人乳腺癌细胞增殖活性的研究

李 明，刘 霞，郭书翰，董 玫，宋铁鹰，史清文

（1.河北省石家庄市第一医院外一科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄050017；3.河北省石家庄市第一医院麻醉科，河北

石家庄050011；4.河北医科大学药学院天然药物化学教研室，河北石家庄050017）

·论 著·

土木香中倍半萜内酯抑制人乳腺癌细胞增殖活性的研究

李 明1，刘 霞2，郭书翰2，董 玫2，宋铁鹰3*，史清文4

（1.河北省石家庄市第一医院外一科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄050017；3.河北省石家庄市第一医院麻醉科，河北

石家庄050011；4.河北医科大学药学院天然药物化学教研室，河北石家庄050017）

目的检测6种倍半萜内酯化合物对人乳腺癌细胞增殖活性的影响，并探讨其可能的作用机制。方法人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺癌脑转移细胞KT分别与6种倍半萜内酯化合物作用48h，噻唑蓝比色法检测细胞存活率；珊塔玛内酯10μmol/L作用MCF-7细胞24h，双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞内Bax报告基因和激活T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）报告基因的表达。结果异土木香内酯和珊塔玛内酯对2种人乳腺癌细胞均显示极强的抑制作用，呈剂量依赖性，半数抑制浓度仅为4.40μmol/L和4.57μmol/L，而其他试验用倍半萜内酯即使在100μmol/L高浓度下，对人乳腺癌肿瘤细胞的增殖不显示抑制活性；珊塔玛内酯可显著诱导MCF-7细胞内Bax和NFAT报告基因表达（P＜0.01）。结论异土木香内酯和珊塔玛内酯对2种人乳腺癌细胞均显示极强的抑制作用；珊塔玛内酯对人乳腺肿瘤细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导MCF-7细胞的Bax表达，使NFAT激活，导致线粒体膜的转移渗透孔通透性改变，使细胞色素C从线粒体释出，活化caspase 9，进而激活caspase 3，导致细胞凋亡的发生所致。

乳腺肿瘤；细胞增殖；倍半萜类

土木香系菊科旋覆花属植物，为多年生草本，性温，味辛、苦，在我国分布于新疆，其他许多地区常栽培其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。目前已从土木香中分离得到土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等多种倍半萜内酯成分，具有抗肿瘤、抗炎、驱虫、抗菌、降血糖和镇痛等多种生物药物活性［1-2］。本研究首次报道从土木香根纯化的6种倍半萜内酯化合物体外抑制人乳腺癌细胞增殖活性，并探讨倍半萜内酯化合物结构与抗肿瘤活性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂：6种倍半萜内酯化合物异土木香内酯（1）、1，5-二乙酰氧基-3，4-环氧，9-吉玛烯-12，8-内酯（2）、1，5-二乙酰氧基-3，9-吉玛二烯-12，8-内酯（3）、2-羟基-11，13-二氢异土木香内酯（4）、11，13-二氢异土木香内酯（5）和珊塔玛内酯（6）由河北医科大学药学院天然药物化学实验室提供，经高效液相色谱法和氢核磁共振波谱法检查，纯度在99％以上（图1）。噻唑蓝（美国Sigma公司，M-2128）；RPMI-1640培养基（美国，GIBCO）；顺铂（美国Sigma，034k3693）；质粒Bax报告基因（pGBax-Luc）、激活T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells）报告基因（NFAT-Luc）和内参照基因（SV-40-Rluc）由日本千叶大学医学部第一生物化学教室提供。

1.2 细胞系：人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺癌脑转移细胞KT由日本千叶大学医学部第二生物化学教室提供。各细胞接种于直径为100 mm的培养皿中，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃和5％CO2培养箱中培养。

图1 实验用6种倍半萜内酯化合物的结构①异土木香内酯；②1，5-二乙酰氧基-3，4-环氧，9-吉玛烯-12，8-内酯；③1，5-二乙酰氧基-3，9-吉玛二烯-12，8-内酯；④2-羟基-11，13-二氢异土木香内酯；⑤11，13-二氢异土木香内酯，⑥珊塔玛内酯Figure 1 Chemical structures of six sesquiterpene lactones for the experiment①Isoalantolactone；②1，5-diacetoxy-3，4-epoxy-9-germacraen-12，8-olide；③1，5-diacetoxy1-11，13-dihydrogen-3，9-germacradien-12，8-olide；④2-hydroxy-11，13-dihydroisoalantolactone；⑤11，13-dihydroisoalantolactone；⑥Santamarine

1.3 噻唑蓝法检测细胞生存率：参照文献［3-4］中的方法，MCF-7和KT细胞接种于96孔板，每孔含1×104个细胞，按照分组分别加入终浓度0.1％二甲基亚砜（溶剂对照）、顺铂以及6种倍半萜内酯化合物，终浓度为1 000μmol/L，倍比稀释为11个浓度，每组设3复孔，置于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养48h。于培养结束前4h，各培养孔加入5g/L的噻唑蓝10μL。实验终止测定各孔吸光度值（absorbance，A），测定波长λ=570nm，参考波长λ=630nm，计算细胞存活率，存活率（％）=A给药组/A对照组×100％。实验数据用Origin 7.0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的半数抑制浓度值。实验重复3次。

1.4 荧光素酶报告基因检测：参照文献［5］中的方法，以每孔5×104个MCF-7细胞接种于24孔板中，用含10％FBS的RPMI-1640培养液培养细胞24h后，弃去培养液，用PBS洗细胞2次。取500ng荧光素酶基因质粒pGBax-Luc和NFAT-Luc以及5ng内参照基因质粒SV-40-Rluc与1.2g脂质体共同加入0.6mL无血清的RPMI-1640培养液中，混匀室温孵育30min后转入培养孔中。于37℃和5％CO2培养箱中培养3h。弃去转染液，更换含有终浓度为10μmol/L的顺铂和珊塔玛内酯的10％胎牛血清的RPMI-1640培养液1mL，继续培养细胞24h后，弃去培养液，用融解缓冲液裂解细胞后，立即上机检测，记录报告基因pGBax-Luc和NFAT-Luc荧光素酶与内参照基因SV-40-Rluc荧光素酶活性的比值，以此值表示报告基因的相对表达情况。

1.5 统计学方法：应用SAS612统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，分别采用t检验和单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 6种倍半萜内酯化合物对人乳腺癌细胞生存率的影响：100μmol/L的异土木香内酯（1）及珊塔玛内酯（6）显示与阳性对照顺铂相同的抑制肿瘤细胞增殖的活性，对MCF-7细胞生存率分别为7.72％和4.86％，对KT细胞生存率分别为11.80％和13.03％，与空白对照组比差异均有统计学意义（P＜0.01）；其他4种倍半萜内酯对2种人乳腺癌细胞的增殖显示较弱的抑制活性。

2.2 异土木香内酯和珊塔玛内酯对MCF-7细胞和KT细胞增殖活性的作用：异土木香内酯（1）和珊塔玛内酯（6）对MCF-7细胞的增殖显示强于阳性对照顺铂的抑制活性，半数抑制浓度分别为4.40μmol/L和4.57μmol/L，呈现浓度梯度依赖性；阳性对照顺铂对乳腺癌脑转移KT细胞的增殖显示较弱的抑制活性，化合物1和化合物6对KT细胞的增殖显示中等程度的抑制活性，半数抑制浓度分别为29.78μmol/L和31.52μmol/L。见表1。

表1 异土木香内酯和珊塔玛内酯对人乳腺癌细胞增殖的影响Table 1 The effect of isoalantolactone and santamarine on the proliferation of breast tumor cells

2.3 珊塔玛内酯对人乳腺癌细胞内Bax-Luc和 NFAT-Luc基因表达的影响：用10μmol/L的顺铂和珊塔玛内酯分别处理MCF-7细胞24h后，检测顺铂和珊塔玛内酯对MCF-7细胞内报告基因的表达的影响。与对照组比较，珊塔玛内酯可显著诱导MCF-7细胞Bax-Luc和NFAT-Luc的表达，表达率分别为空白对照的2.82倍和3.61倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；强于阳性对照顺铂。

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，居女性恶性肿瘤的首位［6］。在乳腺癌的治疗中，药物治疗占据非常重要的地位，但临床上乳腺癌治疗药物的选择性差，不良反应大，一直束缚着其化学药物治疗的发展，新开发的靶向治疗药物，远期疗效不明确，且治疗费用不菲，所以开发常见植物提取物作为抗乳腺癌药物具有重要的意义和广阔的发展前景。

本研究结果显示，异土木香内酯和珊塔玛内酯对MCF-7细胞和KT细胞均显示极强的抑制作用，强于阳性对照顺铂，为乳腺癌转移的治疗提供了一个新的药物研究基础，而其他实验用倍半萜内酯即使在100μmol/L高浓度下，对人乳腺癌细胞的增殖不显示出抑制活性。异土木香内酯和珊塔玛内酯虽然属于不同的结构类型，都具有不饱和五元内酯环，而其他的4种倍半萜内酯化合物五元内酯环的环外双键饱和后，对乳腺癌细胞和乳腺癌脑转移细胞的增殖活性显著降低或消失，根据实验结果推测：倍半萜内酯化合物抑制人乳腺癌细胞增殖活性与其直型和角型结构无关，不饱和五员内酯是抑制人乳腺癌细胞增殖活性的必需基团。具有不饱和五员内酯但是A-环开环后形成的1，5-二乙酰氧基-3，4-环氧，9-吉玛烯-12，8-内酯对于人乳腺癌细胞的增殖不显示抑制活性，由此推测A-环开环可能是导致桉叶烷型倍半萜内酯的体外抑制肿瘤细胞增殖作用减弱或消失的原因。

目前临床应用的约1/3抗肿瘤药物来自植物，其中包括了植物的原形成分和它们的衍生物，如生物碱类、木脂素类及萜类［7-8］。以往的很多医学实验均已证明，传统药用植物通过很多途径发挥作用，如提高机体免疫功能，诱导细胞凋亡，而且许多抗癌药物可诱导不同类型的敏感肿瘤细胞凋亡。本实验利用双荧光素酶报告基因检测法，初步研究了珊塔玛内酯抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。实验结果显示，珊塔玛内酯可明显诱导MCF-7细胞的Bax表达，使NFAT激活。NFAT是在高钙浓度下，经钙调磷酸化酶催化脱磷酸而被激活的。所以，MCF-7细胞内NFAT的激活反映了细胞内钙浓度的增加。已知，胞内高浓度的钙和促凋亡蛋白Bax，均可导致线粒体膜的转移渗透孔通透性改变，使线粒体中的细胞色素C释出，活化caspase 9，进而激活caspase 3，导致细胞凋亡的发生。因此，本实验结果提示，珊塔玛内酯对MCF-7细胞增殖的抑制作用，很可能是通过以上的途径引发细胞凋亡所致。

［1］ CANTRELL CL，ABATE L，FRONCZEK FR，et al. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia subtomentosa［J］.Planta Med，1999，65（2）：351-355.

［2］ KONISHI T，SHIMADA Y，NAGAO T，et al.Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium［J］.Biol Pharm Bull，2002，25（10）：1370-1372.

［3］ 司徒镇强.细胞培养［M］.北京：世界图书出版社，1996：134-138.

［4］ 李书芹，杨志勇，季艳霞，等.沙立度胺抑制MCF-7和MDAMB-231细胞增殖的体外实验［J］.河北医科大学学报，2008，29（5）：660-661.

［5］ NATSUKO S，TOSHIFUMI K，TAKESHI K，et al.Activation of NFAT signal by p53-K120R mutant［J］.FEBS Letters，2009，583（12）：1916-1922.

［6］ 耿翠芝，吴祥德.乳腺癌临床治疗新概念［J］.河北医科大学学报，2001，22（5）：316-318.

［7］ OJIMA I.Modern Natural products chemistry and drug discovery［J］.JMed Chem，2008，51（9）：2587-2588.

［8］ HARVEY AL.Natural products as a screening resource［J］.Curr Opin Chem Biol，2007，11（5）：480-484.

（本文编辑：赵丽洁）

IN VITRO ANTI-HUMAN BREAST TUMOR ACTIVITY OF SIX SESQUITERPENOID LACTONES FROM INULA HELENIUM

LIMing1，LIU Xia2，GUO Shuhan2，DONG Mei2，SONG Tieying3*，SHIQingwen4
（1.Department of Surgery，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department
of Forensic Medicine，HebeiMedical University，the School of Basic Sciences，Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Anesthesiology，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；4.Department of Medicinal Natural Product Chemistry，the
School of Pharmaceutical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang，050017，China）

Objective To detect the anti-human breast cancer cells effects of six sesquiterpenoid lactones isolated from Inula helenium，and to explore itsmechanism.MethodsThe antihuman breast tumor effects of six sesquiterpenoid lactones were investigated using human breast cancer cell（s MCF-7 and KT）.The cell viabilities were examined by MTT assay.MCF-7 cells were transiently cotransfected by pGBax-Luc and NFAT-Luc reporter plasmid and SV-40-Rluc plasmid.The effects of santamarine of luciferase activity expression were detected by dual-luciferase reporter assays.ResultsIsoalantolactone and santamarine exhibited significantly anti-growth activities to human breast cancer，andhalfmaximal inhibitory concentration value of MCF-7 and KT cell were 4.40μmol/L and 4.57μmol/L exposure.Other sesquiterpenoid lactones demonstrated weak anti-growth activities to cell lines even in the concentration ofmore than 100μmol/L.The reporter gene of pGBax-Luc and NFAT-Luc were observed in response to santamarine.ConclusionIsoalantolactone and santamarine have significant anti-growth activities in human breast cancer cells.The possiblemechanism of the anti-human breast tumor activity of santamarine is through caspase-3 and caspase-9 activation inducing cell apoptosis.

breast neoplasms；cell proliferation；sesquiterpenes

R737.9

A

1007-3205（2013）08-0869-04

2013-02-21；

2013-03-26

国家自然科学基金（81072551）；河北省卫生厅指导性课题（20110550）；河北省科技支撑计划项目（11276103D-89）

李明（1979-），男，河北平山人，河北省石家庄市第一医院主治医师，医学硕士，从事腺体恶性肿瘤诊治研究。

*通讯作者。E-mail：song84989@aliyan.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.001