咯利普兰抑制类风湿关节炎间质性肺疾病患者外周血单个核细胞体外增殖

高雪峰，宋 宁，吴建玲，张瑞芳，段 林，郭宪立

（1.河北省正定县人民医院内科，河北正定050800；2.河北医科大学第二医院呼吸内科，河北石家庄050000；3.河北医科大学第二医院急诊科，河北，石家庄050000）

·论 著·

咯利普兰抑制类风湿关节炎间质性肺疾病患者外周血单个核细胞体外增殖

高雪峰1，宋 宁2*，吴建玲2，张瑞芳2，段 林2，郭宪立3

（1.河北省正定县人民医院内科，河北正定050800；2.河北医科大学第二医院呼吸内科，河北石家庄050000；3.河北医科大学第二医院急诊科，河北，石家庄050000）

目的探讨选择性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4抑制剂咯利普兰对类风湿关节炎间质性肺疾病（rheumatoid arthritis-interstitial lung disease，RA-ILD）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）体外增殖的影响及机制，为选择性PDE4抑制剂治疗RA-ILD提供理论依据。方法采集20例初治活动期RA-ILD患者的PBMC，采用四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）比色法检测RA-ILD患者不同浓度咯利普兰处理的PBMC的增殖活性，采用免疫细胞化学法检测核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65核染色阳性细胞百分率。结果咯利普兰剂量依赖性抑制RA-ILD患者PBMC的增殖活性，并降低NF-κB p65核染色阳性细胞百分率（P＜0.01）。结论咯利普兰可能通过抑制NF-κB活化抑制RA-ILD患者PBMC的增殖活性，具有治疗RA-ILD的潜能。

关节炎，类风湿；肺疾病；咯利普兰；细胞增殖

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多发性、对称性关节病变为主要特征的慢性、进行性、炎性、系统性自身免疫性疾病，见于1％美国人［1］，我国患病率为0.32％～0.36％［2］。RA患者易于罹患间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD），其患病风险约为非RA者的8.96倍［3］。RAILD缺乏有效治疗手段，近年发现，选择性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4抑制剂可通过抑制PDE活性抑制细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）降解，起到抗炎和免疫调节作用，有望用于RA治疗［4］。本研究探讨选择性PDE4抑制剂咯利普兰对RA-ILD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）体外增殖的影响及机制，旨在为选择性PDE4抑制剂治疗RA-ILD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2010年1月—2012年12月于河北省正定县人民医院内科门诊及住院期间确诊为RA-ILD初治患者20例，其中男性9例，女性11例，年龄36～72岁，平均（54.30±10.00）岁，均为活动期。RA诊断依据中华医学会风湿病学分会关于RA的诊治指南［2］；ILD的诊断参照2000年美国胸科协会/欧洲呼吸协会（American Thoracic Society/European Respiratory Society，ATS/ERS）提出的肺间质纤维化的诊断标准［5］。RA-ILD患者均排除其他结缔组织病相关的ILD，包括系统性硬化症、系统性红斑狼疮、多发性肌炎/皮肌炎、干燥综合征、混合性结缔组织病、强直性脊柱炎；排除其他肺部疾病，包括肺炎、肺结核、支气管哮喘、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病及肺癌；除外其他因素引起的ILD；除外长期吸烟和使用激素及免疫抑制剂者。研究符合正定县人民医院人体试验委员会所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器：四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、植物血凝素（plant haemagglutinin，PHA）、咯利普兰、地塞米松为Sigma公司产品；人外周血淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限公司产品；兔多抗核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65由Santa Cruz公司提供；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG由中杉金桥公司提供；二氨基联苯胺显色剂由北京中山生物技术公司提供。RPMI-1640培养基为美国Gibco公司提供，胎牛血清为北京圣马元亨生物技术研究所提供。

1.3 PBMC的分离和培养：晨间空腹无菌条件下抽取10mL静脉血，注入抗凝的离心管中，Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，台盼蓝染色示活细胞率＞95％，细胞总量约5×106个。

1.4 分组和干预：取RA-ILD患者的PBMC按1×106个/mL接种于96孔板，0.1mL/孔。细胞接种后分别加入终浓度为1×10-7mol/L（组1）、1×10-6mol/L（组2）、1×10-5mol/L（组3）、1×10-4mol/L（组4）的咯利普兰、1×10-6mol/L地塞米松（组5），对照组不加药液，仅加入等体积溶媒，总体积0.2mL/孔。调零孔不加细胞悬液，只加含10％胎牛血清RPMI-1640 0.2mL。

1.5 MTT比色法检测PBMC增殖活性：细胞分组药物干预4h后洗去药液，用10mg/L PHA刺激，于5％CO2，37℃，95％湿度条件下培养48h后，每孔加入20μLMTT（5g/L），继续培养4h，终止培养，吸弃培养液，每孔加入200μL DMSO终止反应，振荡摇匀，酶标仪检测吸光值。选择测定波长570nm，参考波长655nm。细胞生长抑制率（％）=（1-实验孔OD570/对照孔OD570）×100％。

1.6 多聚物标记（power vision，PV）免疫细胞化学法检测NF-κB p65蛋白表达率：细胞分组药物干预4h后洗去药液，用10mg/L PHA刺激，于5％CO2，37℃，95％湿度条件下培养1.5h后应用细胞涂片离心机将收集的细胞悬液涂于3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷处理过的载玻片上，自然干燥，冷冰酮固定10min。操作按PV免疫细胞化学试剂盒说明书进行。结果判定，显微镜下观察NF-κB p65蛋白表达阳性细胞为细胞核出现棕黄色颗粒。低倍镜下计数500个细胞。计算出阳性细胞占总细胞数的百分率。细胞核阳性着色百分率可简便而直观地反映出NF-κB p65的表达率。NF-κB p65表达抑制率=（1-实验孔NF-κB p65表达率/对照孔NF-κB p65表达率）×100％。

1.7 统计学方法：应用SPSS13.0软件进行数据处理，计量资料以±s表示，分别采用F检验和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 咯利普兰抑制PHA诱导的RA-ILD-PBMC增殖活性：不同剂量的咯利普兰处理后，RA-ILD患者PBMC的增殖活性较对照组均有不同程度的降低（P＜0.01），且呈现出剂量-效应关系，1×10-7mol/L咯利普兰对PBMC的增殖即有抑制作用，1× 10-4mol/L时抑制率最高；相同浓度时，咯利普兰对PBMC的抑制作用不及激素（P＜0.01），但当浓度增加时，其对PBMC的抑制作用与较低浓度地塞米松相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 咯利普兰抑制PHA：诱导的RA-ILD-PBMC NF-κB p65表达：不同剂量的咯利普兰处理后，RAILD-PBMC NF-κB p65较对照组均有不同程度的降低（P＜0.01），且呈现出剂量-效应关系，1×10-7mol/L咯利普兰对NF-κB p65的表达即有抑制作用，1×10-4mol/L时抑制率最高；相同浓度时，咯利普兰对NF-κB p65的抑制作用不及激素（P＜0.01），但当浓度增加时，其对NF-κB p65表达的抑制作用与较低浓度地塞米松相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 咯利普兰抑制PHA刺激的RA-ILD-PBMC体外增殖及NF-κB表达Table 1 Rolipram inhibited RA-ILD-PBMC proliferation and expression of NF-kappa B stimulated by PHA in vitro（n=20，±s）

表1 咯利普兰抑制PHA刺激的RA-ILD-PBMC体外增殖及NF-κB表达Table 1 Rolipram inhibited RA-ILD-PBMC proliferation and expression of NF-kappa B stimulated by PHA in vitro（n=20，±s）

*P＜0.01 vs control #P＜0.01 vs group 1 △P＜0.01 vs group 2 ☆P＜0.01 vs group 3 by q test

Groups Interventions OD570 value Growth inhibition ratio（％）NF-κB positive rate（％）NF-κB inhibition rate（％）Control 0+PHA10mg/L 0.501±0.052-58.091±5. 49.23±9.18 328-Group 1 1×10-7mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.456±0.310*8.09±12.21 50.001±2.845*13.32±8.41 Group 2 1×10-6mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.383±0.042*#22.86±10.44 44.529±4.333*#23.01±7.59 Group 3 1×10-5mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.331±0.038*#△33.33±10.27 37.144±3.655*#△35.52±8.70 Group 4 1×10-4mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.259±0.038*#△☆47.85±8.87 30.259±3.465*#△☆47.62±6.83 Group 5 1×10-6mol/L dexamethason+PHA10mg/L 0.257±0.043*#△☆48.29±9.33 29.346±4.940*#△☆

3 讨 论

关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失［2］。关节滑膜炎是RA的主要表现，包括肺部病变的关节外病变可明显增加RA的致残率和病死率。RA肺部病变多种多样，其中ILD最具破坏性，可由发病最初的亚临床间质性肺炎逐渐发展为终末期肺纤维化，预后极差，可因呼吸衰竭而死亡。目前关于RA-ILD的病因和发病机制尚不清楚，缺乏有效的治疗药物，因此，对RA-ILD病因病机及治疗药物的研究越来越受到关注［6］。

RA-ILD的发病机制不清，多种因素包括遗传、环境、药物治疗等参与了RA-ILD的发病，这些因素可激活针对肺组织的自身免疫炎症反应，多种免疫炎症细胞活化，释放细胞因子、促纤维化因子，启动并介导了肺组织纤维化不断进展［6］。因此，针对免疫炎症反应的抗炎治疗是研发RA-ILD治疗药物的方向之一。

PDE是一类催化水解cAMP使其转变为失去活性的单核甘酸的关键酶，是cAMP水解的惟一途径，因此，PDE的活性是调控细胞内cAMP信号转导强度和持续时间的重要因素。cAMP是细胞内重要的第二信使，参与了多种免疫炎症反应调节，抑制PDE活性可提高细胞内cAMP水平，从而抑制免疫炎症反应［6］。PDE是一个超级酶家族，根据其氨基酸序列不同、酶动力学特征及对底物的特异性不同，可将其分为PDE1～11共11个家族，它们在不同细胞中表现出特有的功能，其中PDE4广泛分布于免疫炎症细胞，已证实选择性PDE4抑制剂具有较强的抗炎活性，可防治多种免疫炎症性疾病［4］，选择性PDE4抑制剂罗氟司特已经美国食品药品管理局批准上市用于治疗慢性阻塞性肺疾病［7］。动物实验证实选择性PDE4抑制剂咯利普兰具有防治关节病变及肺纤维化的作用［8-9］，我们在前期研究中也证实咯利普兰能下调佐剂关节炎大鼠致炎因子、上调抗炎因子，调节Th1/Th2平衡并改善受损的肺功能［10］，但其是否对RA-ILD患者具有抗炎作用尚未见报道。

本研究采集RA-ILD患者的PBMC进行体外培养，并给予PHA促进其体外增殖，同时给予不同浓度的咯利普兰予以干预，且与地塞米松相对比，结果发现，咯利普兰剂量依赖性地抑制PHA诱导的PBMC体外增殖及NF-κB表达，在1×10-7mol/L即有效，并随着剂量的倍增对PBMC增殖及NF-κB表达的抑制率逐渐增加，以1×10-4mol/L浓度时最为明显，虽然相同浓度的咯利普兰对PBMC的抑制率不及激素，但当剂量达到一定水平时，其对PBMC活性的抑制能够达到与激素相当的水平。

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内能调节多种炎症和免疫基因表达的重要的转录调节因子。NF-κB通常是由p50和p65组成的异二聚体，可通过检测p65的表达反映NF-κB活性变化［11］。本研究发现PBMC活化增殖时，伴随着NF-κB活性增强，应用咯利普兰可抑制NF-κB活化，同时伴有PBMC增殖活性的减低，提示抑制NF-κB活化转位入核可能是咯利普兰抑制PBMC体外增殖的作用机制之一。已有研究［12］证实增强cAMP活性可抑制NF-κB活化，咯利普兰抑制RA-ILD-PBMC内NF-κB，推测与其抑制PDE4、减少cAMP降解、提高细胞内cAMP浓度有关。

综上所述，咯利普兰可能通过抑制NF-κB活化抑制RA-ILD患者PBMC的体外增殖活性。作为新的抗炎药物，选择性PDE4抑制剂在RA-ILD防治中的作用值得我们关注并深入研究。

［1］ OLSON AL，SWIGRIS JJ，SPRUNGER DB，et al.Rheumatoid arthritis-interstitial lung disease-associated mortality［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（3）：372-378.

［2］ 中华医学会风湿病学分会.类风湿关节炎诊治指南（草案）［J］.中华风湿病学杂志，2003，7（4）：250-254.

［3］ BONGARTZ T，NANNINIC，MEDINA-VELASQUEZ YF，et al. Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis：a population-based study［J］.Arthritis Rheum，2010，62（6）：1583-1591.

［4］ IN SL，DING SL，LIN SC.Phosphodiesterase 4 and its inhibitors in inflammatory diseases［J］.Chang Gung Med J，2012，35（3）：197-210.

［5］ AST/ERS.Idiopathic pulmonary fibrosis：diagnosis and treatment international consensus statemen［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161（2）：646-664.

［6］ ASCHERMAN DP.Interstitial lung disease in rheumatoid arthritis［J］.Curr Rheumatol Rep，2010，12（5）：363-369.

［7］ 王颖，宋宁，吴建玲.罗氟司特治疗慢性阻塞性肺疾病临床研究现况［J］.临床荟萃，2012，27（16）：1462-1465.

［8］ FRANCISCHI JN，YOKORO CM，POOLE S，et al.Antiinflammatory and analgesic effects of the phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram in a ratmodel of arthritis［J］.Eur JPharmacol，2000，399（2/3）：243-249.

［9］ PAN JB，HOU YH，ZHANG GJ.Rolipram attenuates bleomycin A5-induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Respirology，2009，14（7）：975-982.

［10］ 宋宁，高雪峰，吴建玲，等.咯利普兰对佐剂关节炎大鼠肺功能及Th1/Th2平衡的影响［J］.河北医科大学学报，2013，34（2）：125-128.

［11］ 杨丹蕾，徐永健，李超乾，等.磷酸二酯酶抑制剂对慢性阻塞性肺疾病患者PBMC中IL-8 mRNA表达的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2005，21（3）：99-101.

［12］ 高维娟，许顺江，丛斌，等.CCK-8抑制LPS作用下大鼠肺间质巨噬细胞NF-κB活性的cAMP-PKA通路研究［J］.中国病理生理杂志，2006，22（10）：23-27.

（本文编辑：赵丽洁）

ROLIPRAM INHIBITS ACTIVITY OF PROLIFERATION IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS FROM RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS
W ITH INTERSTITIAL LUNG DISEASE AND ITSMECHANISM

GAO Xuefeng1，SONG Ning2*，WU Jianling2，ZHANG Ruifang2，DUAN Lin2，GUO Xianli3
（1.Department of Internal Medicine，the People's Hospital of Zhengding County，Hebei Province，Zhengding 050800，China；2.Department of Respiratory Medicine，the Second Hospital of HebeiMedical University，
Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Emergency，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

arthritis，rheumatoid；lung diseases；rolipram；cell proliferation

Objective To investigate the effect of selective phosphodiesterase（PDE）4 inhibitor rolipram on activity of proliferation in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）from rheumatoid arthritis patients with interstitial lung disease（RA-ILD）and its mechanism.MethodsPBMC isolated from 20 patients with untreated active RA-ILD were cultured in vitro.The activity of proliferation in PBMC was detected by methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide（MTT）spectrophotometry and the expression of nuclear factor（NF）-κB was determined by immunocytochemical staining.ResultsRolipram inhibited PBMC proliferation activity，and reduced NF-κB p65 nuclear staining positive percentage in a dose-dependentmanne（r P＜0.01）.ConclusionRolipram may inhibit the proliferation activity of PBMC through the inhibition of NF-κB activation in RA-ILD patients，whichsuggests that selective PDE 4 inhibitors have a potential for the treatment of RA-ILD.

2013-03-25；

2013-04-27

河北省科技厅科技支撑计划（10276105D-50）；河北省2011年医学科学重点项目计划（20110334）

高雪峰（1975-），男，河北正定人，河北省正定县人民医院主治医师，医学硕士研究生，从事呼吸系统疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：songning1972@qq.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.006

R593.22

A

1007-3205（2013）08-0884-04< class="emphasis_bold">ABSTRACT：Objective