辛伐他汀及缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤中TNF-α、IL-4的影响

张 芳，于富军，王艳飞，尹博英

（1.河北大学附属医院心内科，河北保定071000；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院心内科，河北石家庄050082）

·论 著·

辛伐他汀及缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤中TNF-α、IL-4的影响

张 芳1，于富军2，王艳飞1，尹博英1

（1.河北大学附属医院心内科，河北保定071000；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院心内科，河北石家庄050082）

目的探讨辛伐他汀及缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤中肿瘤坏死因α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）的影响。方法雄性Wistar大鼠72只，随机分为4组。①假手术组（Sham，n=9，生理盐水2mL/d，灌胃5周）；②缺血再灌注组（ischemia and reperfusion，IR，n=21，生理盐水2mL/d，灌胃5周）；③辛伐他汀预处理组（simvastatin，Sim，n=21，5mg·kg-1·d-1，灌胃5周）；④缺血预处理组（ischemia preconditon，IPC，n=21，生理盐水2mL/d，灌胃5周）。每组又分缺血30min、再灌注30min、再灌注90min 3个时段。分别测定TNF-α、IL-4，比较2种治疗方法下TNF-α、IL-4的动态变化。结果IR组TNF-α含量均高于Sim组、IPC组，以再灌注30min和再灌注90min差异有统计学意义（P＜0.05）。IR组IL-4含量在再灌注90min时低于Sim组、IPC组中IL-4含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。各时间段IPC和Sim预处理对TNF-α、IL-4的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。结论阿托伐他汀或缺血预处理均可抑制缺血再灌心肌损伤中TNF-α表达，增加IL-4表达，从炎症水平上证实2种治疗方法短期内效果无明显差别。

再灌注损伤；辛伐他汀；肿瘤坏死因子α；白细胞介素4

缺血-再灌注损伤心肌在许多危重疾病状态如心肌梗死溶栓治疗、体外循环术、心脏移植是不可避免的。大量动物及临床试验均证实缺血预处理及他汀类药物干预均可有效减轻心肌缺血-再灌注损伤，但关于两种方法治疗后细胞因子变化的比较报道甚少。本研究主要观察辛伐他汀及缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤中不同时段肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）的动态影响。

1 材料与方法

1.1 动物：雄性Wistar大鼠72只，由河北省实验动物中心提供，体质量270～350g。

1.2 动物模型的建立

1.2.1 分组：雄性Wistar大鼠72只，随机分为4组。对照组（Sham，n=9）；缺血-再灌注组（ischemia reperfusion IR，n=21，生理盐水2mL/d，灌胃5周），结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌缺血30min后再开放；辛伐他汀预处理组（simvastatin，Sim，n=21，5mg·kg-1·d-1，灌胃5周），手术操作同IR组；缺血预适应组（ischemia precondition，IPC，n=21，生理盐水2mL/d，灌胃5周），结扎大鼠左冠状动脉前降支，缺血5min，再灌注5min，反复2次后，缺血5min，再灌注10min，最后行缺血30min后开放。每组又分缺血30min、再灌注30min、再灌注90min 3个时段。

1.2.2 大鼠心肌缺血-再灌注模型的制备：20％乌拉坦1.3mL/100g皮下注射麻醉，记录肢导心电图；气管切开，小动物呼吸机人工呼吸，按2～3mL/100g潮气量、70～80次/min频率给予呼气末持续正压通气，呼吸比为2∶1，压力5～15cmH2O，根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。于左胸第3～4肋打开胸腔暴露心脏，在左心耳下1mm左冠状动脉处，用带5-0丝线不锈钢圆针穿过心肌浅层，稳定10min后将一胶管置于冠状动脉表面，拉线推管，使胶管压迫冠状动脉造成心肌缺血，用纹式钳固定10min，放松结扎线后即行心肌再灌注，其中Sham组不结扎。

动物模型制备成功标准如下。①缺血时缺血区心肌颜色变成暗红色，心肌收缩力明显减弱；再灌注后心肌颜色变成鲜红色，心肌收缩力较缺血时增强。②心肌缺血-再灌注过程中伴有心电图ST段和QRS波振幅和时程的动态变化。

退出标准如下。①肉眼下观察，结合心电图ST段和QRS波群变化，缺血区不足心脏质量的15％者；②结扎冠状动脉左前降支失败或未发现再灌注者；③过度出血或心率明显减慢死亡者；④呼吸、心跳停止超过30s者。

符合以上标准者归入上述分组，直到每时段动物数达7只时停止。

1.3 标本采集及指标测定：所有入组的大鼠待造模成功后，自下腔静脉取血约4mL行TNF-α检测。取血成功后立即将心脏取出，取部分缺血-再灌注区心肌组织行IL-4检测。所有标本均有与组别及时段相对应的编号。TNF-α、IL-4应用放射免疫测量法定量测定。TNF-α、IL-4试剂盒由解放军总医院科研开发中心放免所提供。

1.4 统计学方法：应用SPSS 11.0软件包进行数据处理，计量资料以±s表示，组间比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TNF-α含量在缺血-再灌注中的变化：同一组中TNF-α含量均随再灌注时间的延长而递增。同一时间段，IR组TNF-α含量均高于Sham组、Sim组和IPC组，经再灌注30min和再灌注90min时差异有统计学意义（P＜0.05）。IPC组和Sim组TNF-α含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 肿瘤坏死因子α的浓度Table 1 The concentration of TNF-α（±s，μg/L）

表1 肿瘤坏死因子α的浓度Table 1 The concentration of TNF-α（±s，μg/L）

*P＜0.05 vs Sham #P＜0.05 vs IR by q testIR：ischemia and reperfusion；Sim：simvastatin；IPC：ischemia preconditon

Groups n TNF-α IR 30min IR 30min IR 90min Sham 9 0.94±0.14 1.02±0.10 1.20±0.02 IR 21 1.25±0.07 1.43±0.11*1.93±0.09*Sim 21 1.23±0.02 1.36±0.09*#1.68±0.13*#IPC 21 1.24±0.04 1.38±0.07*#1.67±0.04*#

2.2 心肌组织中IL-4在缺血-再灌注中的变化：同一组中再灌注心肌组织中IL-4含量随时间变化增加。同一时间段，IR组IL-4含量低于Sim组和IPC组，高于Sham组，以再灌注90min时差异有统计学意义（P＜0.05）。IPC组与Sim组IL-4含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 白细胞介素4的浓度Table 2 The concentration of IL-4（±s，pg/g prot）

表2 白细胞介素4的浓度Table 2 The concentration of IL-4（±s，pg/g prot）

*P＜0.05 vs Sham #P＜0.05 vs IR by q testIR：ischemia and reperfusion；Sim：simvastatin；IPC：ischemia preconditon

Groups n IL-4 IR 30min IR 30min IR 90min Sham 9 44.65±3.02 51.84±2.14 54.42±0.54 IR 21 45.93±9.80 53.83±5.78 69.72±7.35*Sim 21 45.69±9.78 56.71±8.90 80.28±7.85*#IPC 21 45.40±9.02 57.88±8.16 78.02±7.01*#

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是心肌组织在较长时间缺血后恢复血流灌注，反而出现比灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍。心肌缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，研究［1］表明主要与以下机制有关，氧自由基、钙超载、血管内皮细胞受损、中性粒细胞激活、炎症介质释放、基因表达谱改变等。

本研究中发现IR组、Sim组、IPC组TNF-α、IL-4水平在心肌缺血再灌注后较缺血前升高，均以再灌注90min最为明显，表明心肌缺血再灌注可引起TNF-α和IL-4升高。心肌缺血再灌注损伤中，氧自由基可激活NF-κB，激活的NF-κB可诱导炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）的释放，TNF-α合成及分泌增加［2］，加重心肌损伤［3］。现已将IL-1、IL-6、IL-8及TNF列入炎症介质的范畴，被称为促炎细胞因子，由Th1细胞分泌。IL-4、IL-10被称为抗炎细胞因子，有Th2细胞分泌。Th1、Th2分别产生的促炎细胞因子和抗炎细胞因子，在炎症过程中它们发挥完全不同的作用。蒋齐勇等［4］研究发现，将雄性大鼠随机分成正常对照组、假手术组和模型组，模型组又分为缺血再灌注3h，5h、24h、3d、7d 5个亚组，以IFN-γ/IL-4比值代表Th1/Th2平衡状况，发现模型组fg12表达、Th1/Th2比值均显著高于正常对照组和假手术组（P＜0.05），且于再灌注6h达高峰。聂毛晓等［5］研究发现大鼠心肌缺血再灌注中TNF-α、IL-4表达增加，抑制促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α的生成，增加抗炎因子IL-4生成，可减轻心肌缺血再灌注损伤。

本研究发现Sim组和IPC组TNF-α水平低于IR组，IL-4水平高于IR组，而2组间相比差异无统计学意义。提示辛伐他汀及缺血预处理均可抑制TNF-α表达，增加IL-4表达。

研究［6］发现，他汀类可通过抑制白细胞和内皮细胞间的相互作用，减少白细胞的渗出，抑制炎症介质的释放和降低引起组织损伤物质的化学活性。王朝晖［7］发现阿托伐他汀可减少急性缺血-再灌注后心肌和外周血中TNF-α的表达。费爱华等［8］发现辛伐他汀可抑制促炎因子TNF-α的生成，增加抗炎因子IL-4生成，对缺血-再灌注心肌损伤起保护作用。这可能与他汀类药物破坏氧化应激，降低还原型辅酶活性，抑制核因子NF-κB、髓过氧化物酶、白细胞的黏附和活性剂炎症介质的表达，上调抗氧化酶［9］及一氧化氮合酶活性［10］有关。研究［11-12］发现，缺血预处理，可抑制缺血-再灌注心肌TNF-α表达，可能与抑制NF-κB激活有关。而多数学者认为NF-κB的激活是各种炎症反应中炎症介质表达的总开关和炎症介质网络的中心环节。它活化后能调控包括TNF-α在内的基因的表达，并影响多种病理生理过程。

总之，辛伐他汀及缺血预处理均可抑制TNF-α表达，增加IL-4表达，减轻缺血再灌注心肌损伤，可能与抑制NF-κB激活有关，从炎症水平上证实2种治疗方法短期内效果差异无统计学意义。随着对他汀类药物研究的深入，其作为抗心肌缺血-再灌注损伤的独特作用必将具有更为广阔的临床应用前景。

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（本文编辑：赵丽洁）

EFFECT OF SIMVASTATIN AND ISCHEM IA PRECONDITON ON TNF-α
AND IL-4 IN RATS IN VIVO DURING HEART ISCHEM IA AND REPERFUSION INJURY

ZHANG Fang1，YU Fujun2，WANG Yanfei1，YIN Boying1
（1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Hebei University，Hebei Province，Baoding，071000，China；2.Department of Cardiology，Bethune International Peace Hospital of PLA，
Hebei Province，Shijiazhuang 050082，China）

ObjectiveTo study the effect of simvastatin and ischemia preconditon（IPC）on tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-4（IL-4）in rats in vivo during ischemia and reperfusion injury of heart.MethodsSeventy-twomale Wistar rats were random ly divided into four groups：①Sham operated group（n=9，normal saline 2mL/d，5 weeks）；②ischemia and reperfusion（IR）group（n=21，normal saline 2mL/d，5 weeks）；③simvastatin（Sim）group（n=21，simvastatin 5mg·kg-1·d-1，5 weeks）；④ischemic precondition（IPC）group（n=21，normal saline 2mL/d，5 weeks）.Every group was divided into three subunits：post-ischemia for30minutes，reperfusion for 30minutes and 90minutes.After surgical procedures，the levels of TNF-αand IL-4 weremeasured.ResultsThe concentration of TNF-α in IR group was higher than that in Sim group and IPC group，especially at reperfusion for 30 minutes and 90 minute（s P＜0.05）.The concentration of IL-4 in IR group at reperfusion for 90 minutes were lower than that in Sim group and IPC group（P＜0.05）.No differences of the concentration of TNF-αand IL-4 were found in Sim group and IPC group（P＞0.05）.ConclusionBoth of simvastatin and IPC could decrease the concentration of TNF-αand increase the concentration of IL-4 in ischemia and reperfusioninjury of heart.At inflammation level，the two treatments proved no significant difference in short-term effect.

reperfusion injury；simvastatin；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-4

R542.22

A

1007-3205（2013）08-0873-04

2013-01-24；

2013-03-27

张芳（1979-），女，河北保定人，河北大学附属医院主治医师，医学硕士，从事心血管内科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.003