三磷酸腺苷降解产物评价冷鲜罗非鱼片新鲜度

刘寿春，钟赛意，李平兰，马长伟,*，杨信廷

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.国家农业信息化工程技术研究中心，北京 100097；3.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524005)

三磷酸腺苷降解产物评价冷鲜罗非鱼片新鲜度

刘寿春1,2，钟赛意3，李平兰1，马长伟1,*，杨信廷2

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.国家农业信息化工程技术研究中心，北京 100097；3.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524005)

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定冷鲜罗非鱼片贮藏过程三磷酸腺苷(ATP)降解产物的变化，提出ATP降解产物新型的鲜度评价指标Ki、H、Fr值。通过综合分析感官特征、挥发性盐基氮、耐冷菌和ATP降解产物及其K值相关值等的变化来评价鱼片新鲜度。结果表明：RP-HPLC法能快速准确检测ATP降解产物含量；冷鲜罗非鱼片贮藏过程中ATP快速分解生成肌苷酸(IMP)；ATP、二磷酸腺苷(ADP)和腺苷酸(AMP)含量均不超过0.50μmol/g，IMP初始值达到3.88μmol/g最高含量后持续分解产生次黄嘌呤核苷(HxR)和次黄嘌呤(Hx)，以Hx积累为主；初始Hx含量很低，随着新鲜度下降不断增加至贮藏末期2.35μmol/g；Hx在腐败期快速生成与微生物代谢产生异味高度相关。K值与感官评价、微生物数量相关性最高，H值和Hx也可代替K值成为鱼片新鲜度的评价指标。

冷鲜罗非鱼片；ATP降解产物；新鲜度；RP-HPLC

鱼死后肌肉发生一系列复杂的生化变化，包括肌肉内源酶自溶作用和外源微生物作用，使鱼肉新鲜度不断下降，最终导致腐败。鱼类新鲜度的评价方法很多，包括感官评价、微生物、生化指标、物理指标等[1]。其中三磷酸腺苷(ATP)降解产物是评价鱼类新鲜度的一个重要指标，肌苷酸(IMP)和次黄嘌呤(Hx)是ATP降解过程的中间产物和终产物，与鱼肉的鲜味和异味有密切关系[2]；Saito等[3]探索与鱼肉新鲜度相关的生化变化基础研究，提出K值可作为水产品加工原料的鲜度指标，但是不同鱼类ATP的代谢途径和终产物的积累不同，其他学者相继通过研究ATP降解产物浓度、K值及其相关值来评价鱼类的新鲜度[4-6]。目前国内大多数采用挥发性盐基氮(totalvolatile basic nitrogen，TVBN)等常规方法判定水产品质量下降及初期腐败程度，很少采用ATP降解产物作为新鲜度的评价指标。由于鱼种、养殖方式、捕捞方式、宰杀和加工方式不同均会影响ATP代谢产物的种类和含量[5,7]，因此，有必要针对特定品种及处理方式研究其作为鲜度评价指标的可行性。冷鲜罗非鱼片是近年来罗非鱼加工企业兴起的出口产品，其新鲜度备受消费者关注。本研究建立ATP降解产物的反相高效液相色谱法(reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)快速测定方法，探讨ATP降解产物贮藏过程的变化规律与新鲜度的关系，为早期准确评价冷鲜罗非鱼片新鲜度提供理论依据，亦为其他淡水鱼的新鲜度评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活淡水罗非鱼(Oreochromis niloticus)取自北京国家罗非鱼良种场，击杀加工成生鲜鱼片，采用托盘加盖保鲜膜包装，加碎冰于0～4℃运往实验室，置于0℃恒温冷库贮藏，所有过程不超过12h。每隔一段时间随机取出8片鱼片进行分析。

高氯酸、甲基红、次甲基蓝、盐酸、氢氧化钠、乙醇、磷酸、三乙胺、甲醇等化学试剂(均为分析纯) 北京蓝弋生化试剂有限公司；CVT琼脂 北京陆桥技术有限责任公司；ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx标准品 美国Sigma-aldrich公司。

1.2 仪器与设备

JG21002百分之一电子天平 上海天平仪器厂；KDY-9820凯氏定氮仪 北京通润源机电技术有限责任公司；酸式滴定管 泰兴市铭泰科教仪器设备有限公司；LC-10 AT液相色谱仪 日本岛津公司；C18-Diamondsil反相色谱柱 迪马科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官评价

试验前采用Stone等[8]方法对感官评价人员进行味觉初筛和感官培训，筛选6～8名评价人员，参考Korel等[9]制定感官评价标准如表1所示，分值越高，鲜度越好；当超过半数评价人员感官拒绝时为该鱼片的货架期终点。

1.3.2 耐冷菌的测定

无菌操作取25g鱼片样品置于225mL无菌生理盐水中，振荡均匀，做10倍系列稀释，选取适宜稀释度接种于CVT琼脂，20℃培养72h，计算红色菌落，换算成对数值lg(CFU/g)，简称lg。

1.3.3 挥发性盐基氮的测定

准确称取10g混合肉样，加90mL高氯酸，均质，浸渍30min，于3000r/min离心15min，过滤，取5mL滤液于半自动凯氏定氮仪中蒸馏6min，接收液用0.01mol/L的HCl溶液滴定至中性，通过HCl溶液用量换算TVBN含量/ (mg/100g)。

1.3.4 ATP降解产物的测定[10]

取5g均匀肉样放入离心管，加入15mL 0.6mol/L的高氯酸溶液，均质1min，于10000r/min、4℃离心15min，取上清液；重复操作1次，合并2次上清液，定容至25mL棕色容量瓶中；取10mL样液用KOH溶液调pH值为6.5～6.8，静置30min，过滤，滤液用pH7.0的磷酸钠缓冲液定容至25mL；取适量样液通过0.45μm有机滤膜，滤液直接测定或于-20℃保存。RP-HPLC检测条件：岛津LC-10 AT液相色谱仪，C18-Diamondsil反相色谱柱(25cm×4.6mm，5μm)，流动相为磷酸-三乙胺-甲醇溶液(4%-7%-5%)，pH6.50；流速1.1mL/min，波长254nm，上样量10μL。在相同条件下测定ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx单标及混合标准液的种类和浓度，绘制标准曲线，通过比较样品和标准品的保留时间和峰面积来确定各标准品的种类和含量。

1.3.5 K、Ki、H、Fr值的计算[7]

K/%=[(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)] ×100 Ki/%=[(HxR+Hx)/(IMP+HxR+Hx)]×100 K/%=[(Hx)/(IMP+HxR+Hx)]×100 Fr/%=[(IMP)/(IMP+HxR+Hx)]×100

2 结果与分析

2.1 冷鲜罗非鱼片贮藏过程感官品质变化

表1 冷鲜罗非鱼片感官评价表Table1 ensory evaluation of chilled tilapia fillet

0d新鲜鱼片具有清新河草味、质地结实有弹性，表面无黏液，红白纹理颜色鲜亮。随着贮藏时间延长，鱼片感官接受性分值随着异味产生不断下降。生鱼片异味特征依次为河草味减弱、无味、轻微氨味、浓郁氨味、H2S、腐烂味。当13d出现轻微氨味时，感官可接受性开始明显下降，到17d已经明显腐败。如图1可知，小于13d鱼片可接受，大于17d鱼片腐败，在13～17d之间是感官可接受临界点。由于肉的腐败产物从肌肉内部向外扩散，熟肉品尝可以明显区分肉的鲜甜味和异味，因此熟肉滋味对于感官可接受性具有决定性作用[1]。基于安全性考虑，13d以后感官拒绝品尝时，煮制锅盖刚打开瞬间散发的熟肉气味也是评价鱼肉新鲜度的良好时机。根据熟肉品尝实验，新鲜鱼片的煮制气味和滋味具有愉悦的鲜甜味，肉质滑嫩、多汁性丰富；随着贮藏时间延长，鲜甜味逐渐变得清淡(约9d)至出现异味、口感干燥、肉质发糜。从鲜甜滋味来判定，鱼片高品质期为0～3d，可接受期为3～9d，9～13d可接受临界点，大于13d不可接受。ATP降解产物中的IMP、Hx与滋味密切关联，可考虑建立其新鲜度的量化关系。

图1 冷鲜罗非鱼片贮藏过程总体可接受性的变化Fig.1 Change of overall acceptability in chilled tilapia fillet during storage

2.2 冷鲜罗非鱼片贮藏过程耐冷菌的变化

图2 冷鲜罗非鱼片贮藏过程耐冷菌的变化Fig.2 Change of psychrotrophic bacteria in chilled tilapia fillet during storage

耐冷菌是低温贮藏鱼类的主要腐败菌，如图2所示，耐冷菌6d以前仍在适应0℃低温环境，数量没有明显变化(5.01～5.09(lg(CFU/g))，6d以后，耐冷菌渡过延滞期进入对数生长期，至17d基本到达稳定期(9.09(lg(CFU/g))，呈现经典的S型生长曲线。国际食品微生物委员会规定鲜鱼可接受微生物限值为7.0(lg(CFU/g))有氧中温菌数[11]。按此规定，鱼片货架期介于9～13d，耐冷菌数量6.26～7.76(lg(CFU/g))，根据感官评价13d仍可接受；当感官不可接受时，耐冷菌数量7.76～9.09(lg(CFU/g))(13～17d)。许钟等[12]研究表明0～15℃贮藏罗非鱼中嗜冷的假单胞菌和菌落总数数量非常接近，其最低腐败量为7.42～7.82(lg(CFU/g))，与本研究13d耐冷菌数量较为相近。Jorgensen等[13]研究表明，微生物数量≥7.0(lg(CFU/g))时冰鲜鳕鱼片产生难闻的气味和滋味。根据耐冷菌数量变化和感官异味产生的相互关系，考虑过高微生物数量对人体的危害，可将罗非鱼片新鲜度的耐冷菌数量划分为：小于等于5.0(lg(CFU/g))为高品质期(0～3d)，5.0～6.3(lg(CFU/g))为二级新鲜(6～9d)，6.5～7.0(lg(CFU/g))可接受临界点(9～11d左右)，大于7.0(lg(CFU/g))为不可接受(大于等于13d)。

2.3 冷鲜罗非鱼片贮藏过程挥发性基氮的变化

图3 冷鲜罗非鱼片贮藏过程挥发性盐基氮的变化Fig.3 Change of total volatile basic nitrogen in chilled tilapia fillet during storage

挥发性盐基氮(TVBN)是鱼类新鲜度评价的常用指标，它是微生物分解蛋白质生成低级胺类的综合产物，包括氨、二甲胺、三甲胺等挥发性含氮化合物，多数情况下随着鱼鲜度的下降而增加[1]。GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》规定，海水鱼和淡水鱼的TVBN应不超过30mg/100g和20mg/100g。有作者认为，淡水鱼TVBN≤10mg/100g新鲜度很好；TVBN≤15mg/100g新鲜度较好；TVBN≤20mg/100g新鲜度较差，仍可食用；TVBN＞20mg/100g为腐败鱼，不能食用[14]。按此划分，小于等于6d为新鲜(7.52～9.88mg/100g)，9d(18.12mg/100g)左右是临界点，大于等于13d(25.58mg/100g)为腐败鱼。可见耐冷菌超过7.0lg以后，TVBN增长速度加快。研究表明当TVBN接近可接受限值时，微生物数量到达7.0(lg(CFU/g))[15]。但也有研究表明TVBN在贮藏过程中有先下降后上升的波动[16-17]，认为TVBN应作为鱼肉后期腐败的标志，而早期新鲜度评价常采用ATP降解产物和K值[17]。

2.4 ATP降解产物的测定方法及其鲜度评价

2.4.1 RP-HPLC方法测定ATP降解产物

图4为ATP降解产物混合标准品的RP-HPLC图谱，在该色谱条件下22min内6个标准品均得到良好分离，基线漂移小，峰型对称，没有干扰峰。除了IMP最低检测线为1μg/mL，其他均为0.1μg/mL；各标准品梯度质量浓度与峰面积的回归系数均在0.98以上；因此本方法可用于定量，且检测速度快。

图4 ATP降解产物混合标准品的RP-HPLC图谱Fig.4 RP-HPLC chromatogram of the mixed standards of ATP degradation compounds

2.4.2 冷鲜罗非鱼片贮藏过程ATP降解产物含量的变化

图5 冷鲜罗非鱼片贮藏过程ATP降解产物含量的变化Fig.5 Change of ATP degradation compounds in chilled tilapia fillet during storage

鱼类死后肌肉ATP降解途径一般按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx进行，ATP降解为ADP、AMP和IMP会在几小时至几天内完成，使IMP达到峰值，而IMP进一步降解为HxR和Hx的过程相对比较缓慢[7,18]。如图5所示，ATP降解过程主要变化为IMP逐渐减少，Hx不断积累，HxR作为中间产物积累的同时也在分解。0d新鲜时罗非鱼片中ATP降解产物均能检测到，其中IMP含量最高，表明鱼体宰后经过进一步加工处理，使ATP转变成IMP的过程迅速发生，未见ADP和AMP明显增加，HxR和Hx含量也很低(小于等于0.5μmol/g)，此时鲜度很好。

ATP含量从第0天0.50μmol/g快速下降到第3天0.10μmol/g，下降幅度达80%；至21d ATP几乎消失(0.03μmol/g)。Watabe等[19]研究表明日本鲤鱼在贮藏过程中ATP有个短暂的上升过程随后再下降，ATP下降速度与处理方式和贮藏温度有关。低温贮藏的蝶鱼和日本对虾其ATP含量快速下降与高活性的ATP酶有关，低温下肌肉肌浆网状结构的钙吸收能力下降，肌原纤维内钙浓度增加，而钙离子具有激活Mg2+-ATP酶的作用，使ATP快速降解[20]。ADP从0.26μmol/g初始值略上升至第3天0.34μmol/g，此后一直呈下降趋势，至25d ADP含量甚微(0.06μmol/g)。AMP始终保持在一个相对较低且平稳的水平，新鲜鱼中含有0.26μmol/g，6d后降至0.11μmol/g，随后逐渐回升至0.21μmol/g。相比之下，IMP含量较其他产物高，0d时达到最大值3.88μmol/g，13d以前浓度维持在2μmol/g水平，直至13d下降速度加快，从1.97μmol/g下降至25d 0.05μmol/g。IMP是ATP降解的中间产物，也是重要的鲜味物质，新鲜鱼肉鲜甜味与高含量的IMP密切相关[21]。

贮藏期间，HxR含量呈现先上升后下降，从初始含量0.12μmol/g逐渐上升至17d最大值0.98μmol/g，随后缓慢下降。Hx含量一直呈上升趋势，尤其在9d后上升速度加快，从0.63μmol/g上升到13d 1.20μmol/g，随后逐渐上升至贮藏末期2.35μmol/g。Hx含量增加会产生苦味和异味，因此有学者提出采用Hx作为鱼肉鲜度评价的指标[22-23]。不同鱼种ATP分解产生HxR和Hx的含量有差异，如Hx型鱼种、HxR型鱼种以及中间型鱼种，不同贮藏温度对其两者的积累方式也有影响[24]。

2.4.3 ATP降解产物与感官品质的相互关系

图6 IMP和Hx含量与冷鲜罗非鱼片感官可接受性的回归分析Fig.6 Correlation between sensory acceptability and the contents of Hx and IMP in chilled tilapia fillet

IMP是主要鲜味成分之一，而Hx感官上略带苦味，其两者对于鱼肉风味构成作用相反，因此高含量IMP和低含量Hx为感官鲜味最佳时期。如图6所示，Hx(R2= 0.92)与感官可接受性比IMP(R2=0.76)具有更好的线性关系。当罗非鱼片保持较高品质时(3.8～5分)Hx含量在0～0.5μmol/g，此时没有异味没有苦味；当Hx＞1.6μmol/g时，感官评价已不可接受，呈现氨味、H2S等异味；当Hx＞2.0μmol/g时，鱼片明显腐败。当IMP＞4.0μmol/g，鱼片非常新鲜；2.0～4.0μmol/g可接受，但鲜味逐渐减少；＜2.0μmol/g时，鱼片出现异味。因此IMP可作为鲜甜味的评价指标，而Hx在贮藏过程不断积累可能与微生物大量繁殖有关[23]。

表2 冷鲜罗非鱼片贮藏 ATP 降解产物与品质指标的相关分析Table2 Correlation between ATP degradation products and quality indicators in chilled tilapia fillets

2.4.4 冷鲜罗非鱼片贮藏过程K、Ki、H、Fr值的变化

图7 冷鲜罗非鱼片贮藏过程K、Ki、H、Fr值的变化Fig.7 Change of K、Ki、H、Frvalue in chilled tilapia fillet during storage

鱼死后至僵硬期间，ATP迅速分解，K值增加很快；因为这段时间蛋白质分解速度很缓慢，因此认为K值比TVBN更能准确地反映出鱼的鲜度质量，并在海水鱼和淡水鱼鲜度评价中得到广泛应用[4-7,23]。K值越小鲜度越好，K值越大则鲜度越差。一般认为即杀鱼体的K值≤ 10%，日本生鱼片K值≤20%为生鲜品，20%～40%为一级鲜度，40%～60%为二级鲜度，小于60%则为腐败初期[3]。如图7所示，结合感官评价和K值来评价鱼片新鲜度，0～3d为一级鲜度(K值＜20%)，6～9d为二级鲜度(K值，20%～40%)，9～13d为三级鲜度(K值，40%～60%)，超过13d则感官不可接受。

由于ATP降解途径随鱼种、鱼体部位、宰前处理、季节和贮藏条件而变化[7,25]，可能某一个比例更适合于某一种鱼类。因此学者不断提出K值以外的Ki、G、P、H、Fr值作为不同鱼类的评价指标[4-7,26]，其中H和Fr值分别被称为Hx率和IMP率。如在北美冰藏大西洋鳕鱼(快速HxR积累型)在贮藏过程中，采用G值更胜于Ki值[27]；而H值比Ki值更适于冰藏太平洋鳕鱼[28]。Alasalvar等[25]研究发现K、Ki、G值与冰藏欧洲海鲷鲜度变化具有高度相关性(r=0.99)。K、Ki、P、H、Fr值与野生欧洲鳗鱼贮藏时间的线性回归系数均大于等于0.95[4]。Özogul等[6]认为4℃贮藏野生白鲶鱼的K、Ki、G和H值快速上升是由于IMP迅速消耗导致。Özyurt等[5]研究不同捕获方式对冰藏土耳其pike perch品质的影响，结果表明所有捕捞方式的K和Ki值与品质线性回归均不理想，故不适用于该鱼的鲜度评价。

ATP降解过程中，ATP、ADP、AMP含量很低，主要变化是IMP下降、Hx与HxR的积累，因此本实验以IMP、Hx和HxR三者计算比例与K值进行比较以评价是否适用于罗非鱼新鲜度。如图7，初始K、Ki、H、Fr值分别为8.19%、10.12%、7.37%、89.88%，Fr值随着鲜度下降而下降，K、Ki、H值均随着时间延长不断上升，其中K和Ki值变化趋势非常相近。9d以前H值增长速度较其他值慢；当感官出现异味时(13d)，K、Ki、H、Fr分别为59.23%、69.39%、39.21%、30.61%；小于13d以后，K、Ki值逐渐趋于相对稳定，H值仍呈快速上升趋势；至25d以后，K、Ki、H、Fr均处于稳定阶段。如表2所示，K值与贮藏时间、耐冷菌、感官可接受性的相关性高于TVBN、Ki、H、Fr(R＞0.93)。但为了精简测定指标和步骤，Hx或H值可以替代K值成为鱼片新鲜度的评价指标。按照1.5节方法，12min内可完成Hx、HxR和IMP检测，并计算H和Fr值，有效提高检测速度。

2.5 ATP降解产物与品质指标的相关性分析

各指标相关性分析见表2。如表2所示，ATP降解产物(除了HxR)及相关比值与贮藏时间、耐冷菌、TVBN、感官可接受性具有高度相关性(r，0.896～0.980)。其中，K值与贮藏时间、耐冷菌、可接受性的相关性(r，0.934～0.976)高于TVBN、Ki、H、Fr，次之为Hx(r，0.939～0.970)和H值(r，0.925～0.961)。综合考虑，为了精简测定指标和步骤，Hx或H值可考虑替代K值作为鱼片新鲜度的评价指标。按照1.3.4节方法，12min内可完成Hx、HxR和IMP检测，并计算出H和Fr值，有效提高检测速度，加快评价进程。

3 结 论

采用RP-HPLC方法可以快速准确检测ATP降解产物。冷鲜罗非鱼片贮藏过程中ATP快速分解主要生成IMP，IMP分解终产物以Hx为主；Hx与感官异味出现的分值高度相关。K值、Hx、H值与贮藏时间、微生物、TVBN高度相关。为精简检测指标并加快检测速度，Hx和H值可替代K值作为冷鲜罗非鱼片的鲜度评价指标。

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Evaluation of Freshness of Chilled Tilapia Fillets by Adenosine Triphosphate Degradation Products

LIU Shou-chun1,2，ZHONG Sai-yi3，LI Ping-lan1，MA Chang-wei1,*，YANG Xin-ting2
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing 100097, China；3. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524005, China)

Changes in adenosine triphosphate (ATP) degradation compounds were monitored by reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) during storage of chilled tilapia fi llets, and thefreshness indicators as the values of Ki, H and Frwere proposed. The fi llet freshness were evaluated by integrated measurements of sensory attributes, total volatile basic nitrogen, psychrotrophic bacteria, ATP degradation products and their proportions as K related values. The results showed that the concentrations of ATP degradation products could be detected accurately and rapidly by RP-HPLC. During chilled storage of tilapia fi llets, ATP was observed to degrade rapidly into inosine monophosphate (IMP) and the content of ATP, adenosine diphosphate (ADP) and adenosine monophosphate (AMP) remained below 0.50 μmol/g. Meanwhile, IMP reached the highest level of 3.88 μmol/g initially and degraded into HxR (inosine) and hypoxantjine (Hx) with the extending storage time, and Hx accumulated. Hx was in very low level initially, and increased gradually into the end level of 2.35 μmol/g with the decrease of freshness. Rapid rise of Hx in spoilage phases was highly correlated the microbiological metabolite off-odors. K value had highest correlation with sensory assessment and microbiological counts while H value and Hx could be indicator of freshness instead of K value.

chilled tilapia fi llets；ATP degradation compounds；freshness；RP-HPLC

TS254.4

A

1002-6630(2013)04-0230-06

2011-11-14

欧盟第六框架科技计划项目(FP6-016333-2)；国家星火计划项目(2010GA600001)；国家“863”计划项目(2011AA100706)

刘寿春(1980—)，女，博士，研究方向为食品质量与安全控制。E-mail：scl2006cau@yahoo.com.cn

*通信作者：马长伟(1965—)，男，教授，博士，研究方向为畜水产品加工及贮藏工程。E-mail：changweima@263.net