Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞增殖、凋亡和周期的影响

夏世金 吴俊珍 孙涛 胡明冬 钱桂生

·论 著·

Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞增殖、凋亡和周期的影响

夏世金 吴俊珍 孙涛 胡明冬 钱桂生

目的观察Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞（PAECs）增殖、凋亡和周期的影响。方法PAECs分为4组：未转染常氧对照组（常氧组）、未转染低氧处理组（低氧组）、Ad⁃βGal转染后低氧处理组（Ad⁃βGal＋低氧组）、Ad⁃Gax转染后低氧处理组（Ad⁃Gax＋低氧组）。在常氧和低氧处理1、3、6 h和12 h后，3H⁃TdR掺入法测PAECs增殖、流式细胞术测细胞周期和凋亡率。结果与常氧组比较，低氧组和Ad⁃βGal＋低氧组PAECs3H⁃TdR掺入量均显著升高（P均＜0.01），低氧6 h最大；Ad⁃Gax＋低氧组与常氧组比较均显著升高（P均＜0.01），与低氧组比较均明显降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最大。与常氧组比较，Ad⁃βGal＋低氧组和低氧组PAECs凋亡率均显著降低（P均＜0.05），低氧6 h最低。Ad⁃Gax＋低氧组与常氧组比较均显著上升（P＜0.01或P＜0.05），与低氧组比较均明显增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h增幅最大。与常氧组比较，低氧组和Ad⁃βGal＋低氧组G0/G1期比例明显降低（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h最低；S期和G2/M期比例显著增加（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h S期比例最大。与常氧组和低氧组比较，Ad⁃Gax＋低氧组G0/G1期比例均显著上升（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h增幅最大；S期和G2/M期比例显著降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最高。结论

Gax基因；低氧；肺动脉高压；内皮细胞；增殖；凋亡；细胞周期

低氧性肺动脉高压（HPH）对人的长期严重危害依然存在。HPH是一治疗极为棘手、高致死率和致残率的病理生理综合征［1］，在老年人中多发。肺内皮细胞和平滑肌细胞是组成肺血管壁最重要的细胞，低氧时这两种细胞结构与功能异常是HPH形成的主要病理生理机制。前期研究发现，低氧下调大鼠肺动脉内源性生长终止特异性同源盒基因Gax转录和蛋白表达，而大鼠经气道转染携带Gax基因的重组腺病毒载体（Ad⁃Gax），发现Gax基因在大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）和肺动脉内皮细胞（PAECs）中均过表达，并能预防低氧诱导大鼠HPH的发生［2］；Ad⁃Gax转染抑制低氧性PASMC异常增殖［2］、诱导细胞凋亡［3］、使细胞 G0/G1比例显著升高、S＋G2/M比例显著降低［4］。但是，Gax基因对PAECs增殖、凋亡和周期有何影响目前尚不清楚。因此，本实验通过Ad⁃Gax转染体外培养的大鼠PAECs，观察Gax基因过表达对低氧性PAECs增殖、凋亡和细胞周期的影响，为进一步研究Gax基因调节HPH的作用与机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂 健康成年雄性Sprague⁃Dawley大鼠，购自复旦大学实验动物中心；携带大鼠Gax基因的重组腺病毒Ad⁃Gax载体和携带大鼠LacZ基因的重组腺病毒Ad⁃βGal载体（由美国波士顿大学Kenneth Walsh博士惠赠）；高糖细胞培养基（DMEM，Gibco，USA）、0.25％胰蛋白酶（Gibco，USA）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、细胞培养板和培养瓶（Coming，USA）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；自动常压缺氧孵箱（德国贺氏公司）；氚标记胸腺嘧啶核苷（3H⁃TdR，上海原子能研究所）；β液闪计数仪（Beckmen）。其余试剂为国产分析纯。

1.2 PAEC的培养、鉴定与低氧处理 取150～200 g成年健康SD大鼠共40只，随机分为4组，每组10只。10％乌拉坦腹腔注射麻醉，无菌取大鼠肺动脉，放入含有100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素PBS平皿，将血管外脂肪组织分离冲洗干净，用细丝线扎住一端血管，用镊子轻轻夹住结扎的血管末端，再用一根铁丝将扎住的末端捅进血管，将血管翻过来，使内皮细胞面朝外，扎住另一端。将血管放入盛有0.1％胶原酶的离心管内，37℃消化15 min，震荡使细胞脱落，离心，洗涤后用DMEM培养液加入10％FBS于10 cm培养皿内培养，细胞生长融合后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。将细胞贴于盖玻片上，以1％的多聚甲醛固定5 min，免疫细胞化学染色检查抗Ⅷ因子相关抗原抗体阳性染色和形态学鉴定细胞。3～5代细胞用于本实验。将细胞放置于自动常压缺氧孵箱中低氧处理。待细胞长至瓶底的70％～80％，换含0.4％胎牛血清DMEM培养基使PASMCs同步生长48 h。在常氧（21％O2）和低氧（2.5％O2）处理后在各观察时间点检测指标。

1.3 实验分组与基因转染 PAECs分为4组：未转染常氧对照组（常氧组）、未转染低氧处理组（低氧组）、Ad⁃βGal转染再行低氧处理组（Ad⁃βGal＋低氧组）、Ad⁃Gax转染再行低氧处理组（Ad⁃Gax＋低氧组）。分别在常氧和低氧处理1 h、3 h、6 h和12 h各时间点检测相应指标。Ad⁃Gax和Ad⁃βGal经扩增、鉴定、纯化后用于实验［2］。待细胞长至80％或接近完全融合成片时，培养24 h后弃培养液，然后吸出培养液，加入感染复数为80的Ad⁃Gax转染液，在37℃、5％CO2细胞孵箱培养1 h后弃转染液。未转染组不加Ad⁃Gax或Ad⁃βGal转染液，其余同转染组。

1.43H⁃胸腺嘧啶核苷（3H⁃TdR）掺入法检测细胞增殖 调整细胞浓度为1×105/ml。分别取各组细胞1 ml接种于96孔培养板，每组每个实验条件设3个重复孔。37℃、5％CO2培养24 h后，每孔加入37 kBq3H⁃TdR，再培养6 h后弃培养基，PBS液终止掺入，加入0.25％胰酶消化细胞，收集细胞于玻璃纤维纸上，生理盐水冲洗3次，用10％三氯乙酸（TCA）固定，无水乙醇脱色，80℃干烤30 min，滤膜烘干后置于闪烁瓶中加入闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数（count perminute，CPM）值。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率 取对数生长期的单层细胞，0.25％胰酶消化，待细胞变圆有脱落趋势时，立即竖起培养瓶，弃去胰酶。加入3～4 ml无钙、镁离子的PBS，用吸管反复吹打使成单细胞悬液。单细胞悬液用70％的冷乙醇固定后，调整细胞浓度为109个/ml；取1 ml细胞悬液，用PBS离心洗2次；弃上清后余下约0.5 ml，加入RNA酶A（每样品约3000活性单位），37℃孵育30 min；冰浴停止RNA酶作用；加入1.5 ml PI染料（50μg/ml，4℃避光孵育30 min；在流式细胞仪上进行检测。实验重复3次。

2 结果

2.1 PAEC的生长与鉴定 细胞培养2 h后可见细胞贴壁。过夜后贴壁细胞明显增多。早期呈多角形或梭形，形成致密的单层细胞时，呈“铺路石”状排列。Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色，可见胞浆呈阳性，胞核呈阴性，证明所培养的细胞为PAECs。

2.2 Ad⁃Gax基因转染对PAECs中CPM值的影响 与常氧组同时点相比较，低氧组PAECs的3H⁃TdR掺入量均显著升高（P均＜0.01），在低氧1～6 h，低氧组PAECs的3H⁃TdR掺入量渐增，6 h最大，低氧12、24 h缓慢下降；与常氧组同时相比较，Ad⁃βGal＋低氧组PAECs的3H⁃TdR掺入量均显著升高（P均＜0.01），但与低氧组比较无统计学差异（P均＞0.05）；与常氧组同时点相比较，Ad⁃Gax＋低氧组PAECs的3H⁃TdR掺入量均显著升高（P均＜0.01），但与低氧组比较，3H⁃TdR掺入量均明显降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h降幅渐增，6 h时降幅最大，低氧12、24 h降幅减小。见表1。

2.3 Ad⁃Gax基因转染对PAECs凋亡率的影响 与常氧组同时点相比较，低氧组和 Ad⁃βGal＋低氧组PAECs凋亡率均明显降低（P均＜0.05），低氧1、3 h，低氧组PAECs的凋亡率渐降，低氧6 h最低，低氧12、24 h缓慢上升；与常氧组同时点相比较，Ad⁃Gax＋低氧组 PAECs凋亡率均显著上升（P＜0.01或P＜0.05），与低氧组比较，凋亡率也均明显增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h增幅渐大，6 h时增幅最大，低氧12、24 h增幅渐减。见表2。

表1 在各种条件下PAECs3H⁃TdR掺入量CPM值比较（±s，n＝3）

表1 在各种条件下PAECs3H⁃TdR掺入量CPM值比较（±s，n＝3）

注：与常氧组比较，∗∗P＜0.01；与低氧组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

时点 常氧组 低氧组 Ad⁃βGal＋低氧组Ad⁃Gax＋低氧组0 h 5935.77±831.54 5954.63±833.56 5944.23±832.18 5950.22±833.07 1 h 5897.98±826.15 9846.69±1378.54∗∗ 9839.72±1377.58∗∗ 8125.37±1137.55∗∗△△3 h 5967.12±835.41 13 068.92±1829.67∗∗ 13 110.11±1835.42∗∗ 11 366.45±1591.31∗∗△△6 h 5929.43±830.26 14 183.65±1985.73∗∗ 14 179.95±1985.19∗∗ 11 973.34±1676.28∗∗△△12 h 5885.83±824.16 12 673.62±1774.31∗∗ 12 701.29±1778.18∗∗ 12 983.86±1817.75∗∗△24 h 5942.74±831.98 8125.47±1137.57∗∗ 8136.24±1139.08∗∗ 8530.29±1194.32∗∗△

表2 在各种条件下PAECs凋亡率比较（±s，％，n＝3）

表2 在各种条件下PAECs凋亡率比较（±s，％，n＝3）

注：与常氧组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与低氧组比较，△△P＜0.01

组别 0 h 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h常氧组 3.95±0.55 3.98±0.57 3.88±0.54 3.91±0.55 3.89±0.54 3.87±0.54低氧组 3.99±0.56 2.05±0.29∗ 2.03±0.28∗ 1.95±0.27∗ 3.07±0.43∗ 2.39±0.33∗Ad⁃βGal＋低氧组 3.89±0.54 2.10±0.29∗ 2.07±0.29∗ 2.13±0.30∗ 3.12±0.44∗ 2.28±0.32∗Ad⁃Gax＋低氧组 3.97±0.56 10.35±1.45∗∗△△11.34±1.59∗∗△△14.45±2.03∗∗△△7.55±1.06∗△△ 6.17±0.86∗△△

2.4 Ad⁃Gax基因转染对PAECs周期的影响 与常氧组同时相比较，低氧组PAECs的G0/G1期比例明显降低（P＜0.05、P＜0.01），低氧1～6 h，低氧组PAECs的G0/G1期比例渐降，6 h最低，低氧12、24 h缓慢上升；而S期和G2/M期比例显著增加（P＜0.05、P＜0.01），S期比例低氧6 h最大。与常氧组同时点相比较，Ad⁃βGal＋低氧组内皮细胞G0/G1期、S期和G2/M期比例出现与低氧组类似的变化，Ad⁃βGal＋低氧组与低氧组各指标无统计学差异（P均＞0.05）；与常氧组同时相比较，Ad⁃Gax＋低氧组PAECs的G0/G1期比例均显著上升（P＜0.05、P＜0.01），与低氧组比较，G0/G1期比例也均明显增加（P＜0.01、P＜0.05），低氧1～6 h增幅渐大，6 h时增幅最大，低氧12 h、24 h增幅减小；与常氧组和低氧组同时相比较，Ad⁃Gax＋低氧组PAECs的S期和G2/M期比例显著降低（P＜0.01、P＜0.05），6 h时降到最低值。见表3。

表3 肺内皮细胞在各种条件下细胞周期变化结果比较（± s，％，n＝3）

表3 肺内皮细胞在各种条件下细胞周期变化结果比较（± s，％，n＝3）

注：与常氧组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与低氧组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 G0/G1 S G2/M常氧组0 h 72.49±10.14 22.32＋3.12 5.18＋0.73 1 h 73.38±10.27 21.94＋3.07 4.69＋0.65 3 h 72.98±10.21 22.01＋3.08 5.03＋0.71 6 h 72.01±10.08 22.85＋3.20 5.13＋0.72 12 h 73.04±10.22 21.92＋3.06 5.04＋0.71 24 h 72.58±10.16 22.22＋3.11 5.19＋0.73低氧组0 h 72.61±10.17 22.52＋3.15 5.11＋0.71 1 h 62.58±8.76∗∗ 24.66＋3.45∗ 12.76±1.79∗∗3 h 59.23±8.29∗∗ 26.78±3.75∗∗ 13.89±1.94∗∗6 h 56.68±7.94∗∗ 36.49±5.11∗∗ 6.84±0.96∗12 h 62.32±8.72∗∗ 33.61±4.71∗∗ 4.03±0.57∗24 h 70.25±9.84∗ 25.12±3.52∗ 4.60±0.63∗Ad⁃βGal＋低氧组0 h 72.71±10.15 21.99±3.08 5.29±0.74 1 h 61.97±8.68∗∗ 24.75±3.47∗∗ 13.28±1.86∗∗3 h 59.78±8.36∗∗ 27.67±3.87∗ 12.54±1.76∗∗6 h 55.98±7.84∗∗ 37.13±5.19∗∗ 6.88±0.96∗∗12 h 62.41±8.73∗∗ 33.91±4.74∗∗ 3.67±0.51∗24 h 69.98±9.80∗ 25.36±3.55∗ 4.65±0.65∗Ad⁃Gax＋低氧组0 h 72.40±10.13 22.16±3.12 5.20±0.73 1 h 76.34±10.69∗△△12.94±1.78∗∗△△10.67±1.48∗∗△△3 h 80.45±11.26∗∗△△11.57±1.62∗∗△△7.97±1.12∗△△6 h 86.17±12.34∗∗△△10.27±1.44∗∗△△3.55±0.49∗△△12 h 75.04±10.39∗△△12.02±1.68∗∗△△12.93±1.81∗∗△△24 h 73.93±10.35∗△ 12.96±1.81∗∗△△13.10±1.83∗∗△△

3 讨论

本研究采用比较准确反映细胞增殖的先进方法（3H⁃TdR掺入法）和比较准确反映细胞周期和凋亡率的先进手段（流式细胞术），观察Ad⁃Gax基因转染对体外原代培养的PAECs增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果发现，低氧早期内皮细胞增殖加速，而此时增强Gax基因的表达可抑制细胞的异常增殖，抑制细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期，并诱导细胞凋亡；随着低氧时间的不断延长，细胞增殖受到抑制，而此时增强内皮细胞中Gax基因表达却又激活细胞增殖，促进细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期比例，抑制凋亡，以此来维持细胞的数量。可见，Gax对维持内皮细胞数量的动态平衡具有双向调节作用。

Gax基因是在1993年由Gorski等［5］克隆出的一种同源异形盒（homeobox）基因，其编码的蛋白是一种核转录因子，能够激活或抑制其下游基因的表达。Gax基因抑制内皮细胞异常增殖。增强内皮细胞Gax基因表达可通过p21高表达来抑制促血管生成因子所致的内皮细胞表型转变［6］。体外实验结果显示腺病毒介导Gax基因转染抑制内皮细胞迁移［7］。本研究结果也证实Gax基因过表达抑制内皮细胞的异常增殖，与上述研究结果相符。然而，Gax基因也能促进内皮细胞的增殖。研究发现，增强人脑内皮细胞Gax基因表达能促进新的血管生成，即Gax基因过表达可促进人脑内皮细胞的增殖，提高细胞数量，改善神经血管功能失调［8］。本研结果证实在低氧处理后期，Gax过表达可促进内皮细胞增殖，与上述结果一致。

从本研究结果可以得出Gax基因可能只对异常增殖的细胞具有诱导凋亡的作用，以及Gax对内皮细胞生物学功能具有双向调节作用的新观点。本研究结果表明，当低氧刺激使PAECs数量异常增加时，Gax基因起到抑制细胞数量的作用，而当低氧刺激时间越长，细胞数量逐渐减少时，此时Gax基因却起到阻止细胞数量减少的作用。因此，我们认为，内皮细胞在低氧早期，低氧可能诱发细胞内源性的自我保护机制，激活细胞内促增殖信号通路，促进细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期，促进细胞的增殖，抑制细胞凋亡；而当低氧积累到一定程度，促细胞增殖信号通路渐渐失活，抑制细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期，细胞增殖受到抑制，而凋亡现象减弱。我们推测，当细胞出现异常增殖时，Gax基因就启动细胞内抑制细胞数量的机制，而当细胞数量出现异常减少时，Gax基因却启动细胞内维持细胞数量的机制。而这些机制尚需深入研究。

［1］ McLaughlin VV，Archer SL，Badesch DB，et al.ACCF/AHA 2009 expert consensus documenton pulmonary hyper⁃tension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on ExpertConsensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians；American Thoracic Society，Inc.；and the Pulmonary Hypertension Association［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（17）：1573⁃1619.

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［3］ 夏世金，董竞成，白莉，等.Ad⁃Gax转染对缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的影响［J］.中华内科杂志，2007，46（9）：755⁃759.

［4］ 夏世金，董竞成，邰先桃，等.Gax基因过表达对低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及周期的作用［J］.华西医学，2008，23（3）：562⁃565.

［5］ Gorski DH，Lepage DF，Patel CV，et al.Molecular cloning of a diverged homeobox gene that is rapidly down⁃regulated during the G0/G 1 transition in vascular smoothmuscle cells［J］.Mole Cell Biol，1993，13（6）：3722⁃3733.

［6］ Gorski DH，Leal AJ.Inhibition of endothelial cell activation by the homeobox gene Gax［J］.JSurg Res，2003，111（1）：91⁃99.

［7］ Patel S，Leal AD，Gorski DH.The homeobox gene Gax in⁃hibits angiogenesis through inhibition of nuclear factor⁃kap⁃paB⁃dependent endothelial cell gene expression［J］.Cancer Res，2005，65（4）：1414⁃1424.

［8］ Wu Z，Guo H，Chow N，et al.Role of the MEOX2 ho⁃meobox gene in neurovascular dysfunction in Alzheimer dis⁃ease［J］.NatMed，2005，11（9）：959⁃965.

Effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterialendothelial cells

XIA Shi⁃jin.Shanghai Institute ofGeriatrics；WU Jun⁃zhen，SUN Tao.Department ofGeriatrics，Huadong Hospital，Fu⁃dan University，Shanghai200040，China；HU Ming⁃dong，QIAN Gui⁃sheng.Department of Respiratory Diseases，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China

Objective To study the effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterial endothelial cells. M ethods Rat pulmonary arterial endothelial cells（PAECs）were divided into 4 groups：non⁃transfected normoxia goup（normoxia group），untransfected hypoxic treatment group（hypoxia group），Ad⁃βGal transfection and hypoxic treatment group（Ad⁃βGal＋hypoxia group），Ad⁃Gax transfection and hypoxic treatment group（Ad⁃Gax＋hypoxia group）.Under conditions of normoxia or hypoxia for 1 hour，3 hours，6 hours and 12 hours，cells proliferation was assessed by using3H⁃thymidine（3H⁃TdR）incorporation assay，while cell apoptosis and cell cycle were evaluated with flow cytometry. Results （1）Compared with the normoxia group，the3H⁃TdR incorporation of PAECs was significantly increased in the hypoxia group and Ad⁃βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01）.And it reached themaximum at6⁃hour⁃hypoxia time point.The3H⁃TdR incorporation of PAECs in the Ad⁃Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group（P＜0.01）and lower than the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.The largest decline occurred at6⁃hour⁃hypoxia time point.（2）Compared with the normoxia group，the apoptosis rate of PAECs were significantly decreased in the hypoxia group and Ad⁃βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.05）.And it reached theminimum at6⁃hour⁃hypoxia time point.The apoptosis rate of PAECs in the Ad⁃Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group and the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase occurred at6⁃hour⁃ hypoxia time point.（3）Compared with the normoxia group，the PAECs in G0/G1phases were significantly decreased in the hy⁃poxia group and Ad⁃βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest decline occurred at 6⁃hour⁃hypoxia time point.Whereas the PAECs in S and G2/Mphases were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of S phase PAECs occurred at 6⁃hour⁃hypoxia time point.Compared with the normoxia group and hypoxia group at the same time points，the PAECs in G0/G1phases in the Ad⁃Gax＋hypoxia group significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of G0/G1pha⁃ses PAECs occurred at6⁃hour⁃hypoxia time point.Whereas the PAECs in Sand G2/M phaseswere significantly decreased（P＜0.01，P＜0.05）.The largest increase of S and G2/M phases PAECs occurred at 6⁃hour⁃hypoxia time point. Con⁃clusions Gax plays a bidirectional regulatory role inmaintaining endothelial cells in number homeostasis via regulating cell proliferation，apoptosis and cycle.

Gax gene；hypoxia；pulmonary arterial hypertension；endothelial cell；proliferation；apoptosis；cell cycle

R 544.16

A

10.3969/j.issn.1003⁃9198.2013.12.005

2013⁃07⁃15）

国家自然科学基金（81270115）

200040 上海市，复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所（夏世金），老年医学科（吴俊珍，孙涛）；400037 重庆市，第三军医大学附属新桥医院呼吸科（胡明冬，钱桂生）

Gax基因干预低氧性PAECs增殖、凋亡和周期，双向调节并维持细胞数量稳态。