Graves病治疗前后CD3-CD56+的变化及临床意义

梁金明，陈聪，许琳，李青，欧志莲，刘永鹏

(广东医学院附属湛江中心医院，广东湛江524037)

Graves病治疗前后CD3-CD56+的变化及临床意义

梁金明，陈聪，许琳，李青，欧志莲，刘永鹏

(广东医学院附属湛江中心医院，广东湛江524037)

目的检测CD3-CD56+在Graves病治疗前后变化，探讨NK细胞在治疗过程中的变化及ADCC效应对Graves的影响或作用。方法选取正常对照组22例，Graves病初次发现且未治疗病人33例，抗甲状腺药物(ATD)治疗后缓解患者30例，完全缓解患者12例，及复发患者11例，用流式细胞术检测CD3-CD56+的比值。结果正常对照组结果为7.03±3.91，初发组结果为4.83±2.72，缓解组结果为5.12±3.19，完全缓解组结果为7.91±4.05，复发组结果为6.97±3.28；初发组及缓解组结果低于正常对照组，差异有统计学意义(P=0.018，P=0.043)，初发组结果明显高于完全缓解组，差异有统计学意义(P=0.007)；缓解组结果低于完全缓解组，差异有统计学意义(P=0.016)。结论Graves病CD3-CD56+低于正常，ADCC效应及NK细胞的其他免疫功能有可能受到损害或限制，破坏体内的免疫平衡或免疫功能紊乱。CD3-CD56+结果对Graves各阶段病程的诊断、治疗及预后有临床意义。

Graves病；白细胞抗原分化群CD3-CD56+;自然杀伤细胞;抗体依赖细胞介导的细胞毒作用;流式细胞术

Graves病(Graves’disease，GD)是一种常见内分泌异常疾病，与自身免疫性有关，属Ⅱ型超敏反应，引起这种自身免疫反应的因素还不清楚，其机制之一为NK细胞介导的ADCC效应，而NK细胞的表面标志主要是CD56+及CD16+，有研究表明NK细胞与甲状腺细胞内分泌的自身抗体有关[1]，Graves的病因和复发因素尚未完全清楚，国外对Graves病的治疗主要以[3]I为主，国内对Graves病治疗以ATD较多，但复发率高，给患者造成极大的精神负担和严重影响生活质量，而粤西等沿海地区是Graves病的高发区，本研究通检测正常人群、Graves病初发、缓解、完全缓解及复发患者CD3-CD56+占淋巴细胞比值变化，探讨Graves病程不同阶段的NK细胞变化及ADCC效应。

1 材料与方法

1.1 标本收集与处理在健康体检者中随机选择22例作正常对照组(简称正常组)，根据《内科学》第6版[2]Graves诊断标准分初次发现且未治疗病人33例(简称初发组)，抗甲状腺药物(ATD)治疗后缓解患者30例(TSH、TT3、TT4结果比治疗前有好转，简称缓解组)，完全缓解患者12例(TSH、TT3、TT4结果完全正常，简称完全缓解组)及复发患者11例(TSH、TT3、TT4正常后再出现符合Graves结果，简称复发组)，其中男性39例，女性69例，年龄11～80岁。抽血2ml用EDTA-K2抗凝全血，用流式细胞术检测CD3-CD56+占淋巴细胞比值。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 仪器美国贝克曼库尔特公司FC500流式细胞仪。

1.2.2 试剂CD3-CD56+试剂使用美国贝克曼库尔特公司生产TETRACHROME 45/56/19/3四色试剂盒。

1.3 方法按试剂盒说明及仪器要求操作：缓慢混匀全血后取100μl加入流式仪专用试管中；吸取45/56/19/3四色试剂10μl加入混匀放室温避光孵育15min；加500μl Optilyse C溶血素后放室温避光10min；加500μl BPS室温避光10min；1500r/ min离心5min，弃上清液；加1ml PBS悬浮细胞上机检测。

1.4 统计学分析用SPSS17.0软件对各组CD3-CD56+淋巴细胞百分比进行正态分布及方差分析(student Newman Keuls test)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

正常对组CD3-CD56+结果为7.03±3.91，初发组结果为4.83±2.72，缓解组结果为5.12±3.19，完全缓解组结果为7.91±4.05，复发组结果为6.97± 3.28，初发组与缓解组低于正常对照组及完全缓解组，正常组、完全缓解组及复发组结果差异不显著；正常对照组与初发组、缓解组差异有统计学意义(P＝0.018，P＝0.043)；初发组与正常对照组、完全缓解组差异有统计学意义(P＝0.018，P＝0.007)；缓解组与正常组、完全缓解组差异有统计学意义(P＝0.043，P＝0.016)；完全缓解组与初发组、缓解组差异有统计学意义(P＝0.007，P＝0.016)。

表1 各组别CD3-CD56+平均数、标准差及正态检验

表2 方差分析(student Newman Keuls test)P值表

3 讨论

人自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)是机体免疫系统的重要组成部分，是机体天然免疫系统的主要细胞，产生细胞毒性或分泌细胞因子，在杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞及免疫调节中、免疫应答中发挥的重要作用，有学者报道NK样细胞在免疫功能及肿瘤治疗预后判断的标志指标之一[3]。NK细胞亚群表型和生物学特征及NK细胞受体的识别的多样性也有大量研究[4,5]。NK细胞识别正常组织细胞和变异细胞功能主要受其表面多种活化或抑制性受体调节的研究具有重要意义[6]，NK细胞的表型主要表达CD56+和CD16+而不表达CD3-，可将NK细胞分为CD56hi和CD56lo亚群，并在免疫应答的过程中发挥着不同的生物学功能。NK细胞杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的靶细胞,机制主要是通过Fas(CD95)和FasL(CD95L)的相互作用、TNF和TNF受体的结合以及释放颗粒酶和穿孔素破坏靶细胞。在NK细胞与靶细胞共孵育时,可检测到TNF2α的释放,一般认为TNF2α是由CD56hi细胞所分泌[7]。Mysliwiec等[8]研究结果显示GD病变倾向于Th2型反应或Th1/Th2比例不平衡有关[9]。Giordano等[10]认为,IL21β介导的Fas表达在乔本甲状腺炎细胞的凋亡中起重要作用,同时Fas介导的细胞凋亡可能是乔本甲状腺炎组织破坏的主要病理机制。同时,细胞因子可以调节甲状腺细胞的增殖，IFN2γ、TNF2α和IL21α可以影响TSH介导的细胞增殖效应。细胞因子不仅可以直接影响机体免疫细胞的活性,而且还可以通过影响甲状腺细胞免疫相关分子的表达调节AITD的病程。

ADCC的杀伤机制是通过Fas与FasL起作用的，用活化的NK细胞表面可表达FasL,当NK细胞表达的FasL与靶细胞表面的相应受体Fas(CD 94)结合后形成Fas三聚体,使其胞浆内的结构域相聚成簇并与Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)结合,激活caspase-8,通过级联反应最终导致靶细胞死亡。还可以通过TNF-α与TNFR-I作用途径最终使细胞死亡。NK细胞受体有几十种，通过与配体以特定的模式结合，活化或抑制效应调节NK细胞功能。抑制性受体特异性识别MHCⅠ类分子,抑制NK细胞的杀伤活性和其他效应功能,而活化性受体可被缺乏MHCⅠ类分子的靶细胞激活,当这些活化性受体被相应抗体封闭时,NK细胞杀伤功能降低。

表1及表2结果显示初发组及缓解组CD3-CD56+百分比值均低于正常对照组，差异有统计学意义，完全缓解组与正常对照组CD3-CD56+百分比值结果差异没统计学意义，初发组与完全缓解组CD3-CD56+百分比值差别也有统计学意义。说明有Graves病发生时CD3-CD56+百分比降低，NK细胞低于正常，ADCC效应及NK细胞的其他免疫功能都有可能受到损害或限制，破坏体内的免疫平衡或免疫功能紊乱。当Graves病得到完全缓解时，CD3-CD56+百分比值回复正常，说明ADCC的作用及NK细胞的功能也回复到正常水平。

从表中结果可以看出，缓解及完全缓解时CD3-CD56+百分比值是有差别且有统计学意义的。缓解时CD3-CD56+百分比值还是低于正常，ADCC效应或NK细胞免疫功能还有部分受损或未完全正常，只有完全缓解时，NK细胞免疫功能才完全正常。CD3-CD56+结果对Graves各阶段病程的诊断、治疗及预后有临床意义。

复发组CD3-CD56+百分比值低于正常对照组及完全缓解组，又高于初发组及缓解组，也符合上述NK细胞免疫功能在Graves各病程中的临床意义，能差别没统计学意义，很有可能通过治疗后，免疫功能产生耐受或紊乱所致。

有研究提示NK细胞具有免疫记忆功能，通过胚系基因编码的抑制性受体和活化性受体来识别MHC I类分子及类样分子，经过初次活化后具有记忆性免疫细胞的特征[11]。这也许就是Graves在缓解、完全缓解及复发中CD3-CD56+结果有统计学意义的原因，从而可以通过CD3-CD56+结果来指导临床治疗的辅助依据。同时，在治疗中增强免疫力[12]或调节免疫是否可以令Graves能更快更有效治愈及预防复发有临床意义。

而对于Graves病的免疫机制、NK细胞的作用及ADCC效应的影响有待进一步的研究，如NK细胞表型、生物学活性、分泌因子等，ADCC活性测定等，这些对Graves病中的免疫作用或治疗、预防复发可能都有临床意义。

仅这些理论是不够的，随着NK细胞免疫功能研究的不断发展[13]、ADCC效应及NK细胞活性测定这些研究有待进一步深入，对Graves病的发病机制、免疫功能的的关系及Graves病的治疗和预防复发提供科学的依据。

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The changes and clinical significance of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment

LIAN Jinming，CHEN Cong，XU Lin，et al.Zhanjiang Central Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Guangdong Zhanjiang 524037,China

Objective To detect the changes of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment,study the changes of NK cells during treatment and explore the influence or effect of ADCC on Graves disease．Methods Taking 22 cases of health people as control group，33 cases of untreated GD patients，30 cases of after ATD treatment and remission patients，12 cases of complete remission patients and 11 cases of relapse patients as experimental group,we detected the ratio of CD3-CD56+in all subjects by flow cytometry.Results The results of CD3-CD56+in the health control group，untreated GD patients group，after ATD treatment and remission patients group，complete remission patients group and relapse patients group were 7.03±3.91,4.83±2.72, 5.12±3.19,7.91±4.05,6.97±3.28 respectively.The results of CD3-CD56+in the untreated GD patients group and after ATD treatment and remission patients group were lower than those of the health control group.Differences had statistical significance(P= 0.018，P=0.043).The result of CD3-CD56+in the untreated GD patients group was apparently higher than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.007).The result of CD3-CD56+in the remission patientss group was lower than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.016)．Conclusions The CD3-CD56+of GD is lower than that of normal people，ADCC and the immunolongic function of NK cells are likely to be injured or limited,the body's immune balance is disturbed and the immune function is disorder.The results of CD3-CD56+have the clinical significance in the diagnosis,treatment and prognosis of different stages of Graves Disease.

Graves'Disease；CD3-CD56+；Natural Killer Cells；ADCC；Flow Cytometry

R392．6,R593.2,R581.1

A

1674-1129(2013)03-0220-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.007

湛江市科技攻关项目编号：2010C3105008

梁金明，男，39岁，本科，副主任技师，主要从事免疫医学检测。