探讨外周血hnRNP A2/B1诊断非小细胞肺癌的临床意义

龙颖颖，古艳，李羲，颜春松，都莉

(1、南昌大学第二附属医院，江西南昌330006；2、南昌大学第三附属医院，江西南昌330006；3、海南医学院附属医院)

探讨外周血hnRNP A2/B1诊断非小细胞肺癌的临床意义

龙颖颖1，古艳2，李羲3，颜春松1，都莉2

(1、南昌大学第二附属医院，江西南昌330006；2、南昌大学第三附属医院，江西南昌330006；3、海南医学院附属医院)

目的探讨外周血异质性胞核核糖蛋白A2/B1(Heterogeneous nuclear ribnucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)对非小细胞肺癌临床诊断意义，并分析吸烟对hnRNP A2/B1表达的影响。方法将2009年1月至2012年6月于南昌大学第二附属医院行肺肿块切除术41例非小细胞癌患者分成Ⅰ-Ⅱ期肺癌组17例、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组24例，此外随机取肺部良性病变30例为对照组；又根据是否吸烟分成吸烟组34例，不吸烟组37例。抽提71例患者外周血及肺组织hnRNP A2/B1 mRNA,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)技术，分析3组患者hnRNP A2/B1 mRNA在外周血及病变肺组织的表达差异；并分析吸烟对外周血及肺组织hnRNP A2/B1表达影响。结果hnRNP A2/B1在非小细胞肺癌患者外周血及病变肺组织中表达无显著性差异(P＞0.05),在两肺癌组患者外周血及肺组织的表达较良性病变组显著升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.01);吸烟组hnRNP A2/B1基因表达较不吸烟组升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论检测外周血hnRNP A2/B1诊断非小细胞肺癌具有一定临床意义；吸烟可能是诱导机体hnRNP A2/B1基因表达上调的因素。

异质性胞核核糖核蛋白A2/B1；非小细胞肺癌；吸烟

随着全球大气污染日趋严重，肺癌的发病人数和死亡人数逐年升高，发病率和死亡率高居所有肿瘤之首。肺癌诊断后5年生存率很低，早期诊断可以使I期肿瘤患者的5年生存率达到80%，因此早期诊断肺癌对提高患者生存率是至关重要的。目前早期诊断肺癌的方法有限，随着的分子生物学的发展，很多学者致力于肿瘤标志物的研究，现在已发现10余种与肺癌相关的肿瘤标志物[1]。hnRNP A2/B1是一种癌生长蛋白，与非小细胞肺癌的发生发展密切相关[2,3]，本研究采用RT-PCR技术，分析hnRNP A2/B1基因在肺部良性疾病和非小细胞肺癌患者的外周血及肺病变组织的表达差异，探讨其在非小细胞肺癌诊断中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料71例患者于2009年1月至2012年6月来我院胸外科行肺部包块切除术，术前未行化疗及相关手术治疗，术后经细胞学(和)或病理组织学检查，其中Ⅰ期～Ⅱ期肺癌组17例：鳞癌12例，腺癌5例；男9例，女8例。平均年龄：61.58± 15.63岁。Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组24例：鳞癌14例，腺癌7例，大细胞癌2例，肉瘤1例；男14例，女10例，平均年龄：60.13±16.39岁。肺良性病变组30例：错构瘤14例，肺炎性假瘤5例，纤维瘤3例，其它8例；男19例，女11例，年龄51.57±23.83岁。71例患者依据WHO 1984吸烟调查方法标准化即每天吸烟1支以上，时间长于1年为吸烟者的建议分吸烟组34例，不吸烟组37例。

1.2 方法

1.2.1 外周血及肺病变组织RNA提取及逆转录反应(1)外周血RNA获取：术前抽取2ml外周血TRIzol法提取总RNA。(2)手术获得肺病变组织约100mg，用含1‰DEPC的PBS(pH7.4)洗尽肺组织的血液，TRIzol法抽提肺组织RNA。取上述RNA 10μl，0.05μg/μl Oligo(dT)15 Primer 2μl及无核酶水2μl混匀，然后加入5×M-MLV Buffer 5μl、MMLV 1μl、RNasin 0.5μl、dNTP 1μl及无核酶水3.5μl混匀，用带热盖的PCR仪42℃60min转录成cDNA产物。

1.2.2 引物设计Oligo 6设计引物序列详见表1，以hnRNP A2/B1基因的cDNA为模板设计一对上游和下游引物，扩增片段280bp。此外，为检测RNA提取效果及扩增效率以β-actin为内参设计一对引物，扩增片段600bp。

表1 引物序列

1.2.3 PCR反应及产物分析将cDNA进行hn-RNP A2/B1和β-actin的PCR反应。具体操作：(1) cDNA模板5.0μl，hnRNP A2/B1 Primer(10μM) 1.0μl，β-actin Primer(10μM)1.0μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 5.5μl共计25μl反应体系。(2)反应条件：94.0℃预变性5.0min，94.0℃变性1.0min，60.0℃退火1.0min，72.0℃延伸2.0min，共35循环，最后72.0℃延伸7.0min。(3)结果分析：取PCR产物10.0μl及DNA Marker 5.0μl于2%琼脂糖凝胶中进行电泳。

1.2.4 统计学方法采用SPSS17.0进行统计分析；所有资料均为计数资料，组与组间的比较均用χ2检验，若四格表n＜40或T＜1则采用Fisher确切概率法。P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01认为有显著统计学差异。

2 结果

71个标本均能成功地提取出总RNA(如图1)，75.60%的肺癌组织以及65.85%的血液标本中均有hnRNPA2/B1的基因表达；而肺部良性病变患者组织以及血液中hnRNPA2/B1的基因表达明显减少，表达率分别为26.67%、20%(图2、3)，具体基因表达情况见表2～5。

2.1 血液hnRNP A2/B1的基因检测血液中hn-RNP A2/B1基因表达在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌组与Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组之间比较无统计学意义(χ2＝0.638，P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌组与肺部良性病变组之间比较有显著统计学意义(χ2＝7.284，P＜0.01);在Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组与肺部良性病变组之间比较有显著的统计学意义(χ2＝14.091，P＜0.01)；吸烟患者与不吸烟患者之间进行比较均有显著的统计学意义(χ2＝7.493，P＜0.01)，见表2和表3。

表2 3组血液hnRNP A2/B1的基因检测结果比较

表3 吸烟因素血液hnRNP A2/B1的基因检测结果比较

2.2 肺组织hnRNP A2/B1的基因检测肺组织hnRNP A2/B1基因表达在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌组与Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组之间比较无统计学意义(χ2＝0.397, P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌组与肺良性病变组之间比较有统计学意义(χ2＝8.563，P＜0.01);Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组与肺良性病变组之间比较有显著的统计学意义(χ2＝14.700，P＜0.01)。组织中吸烟患者与不吸烟患者之间进行比较有统计学意义(χ2＝5.386，P＜0.05)。

2.3 血液与组织hnRNP A2/B1基因检测结果比较本研究发现病变肺组织和血液的敏感性及特异性比较无统计学意义。从表2和表4数据比较得出I期-Ⅱ期肺癌组血液与组织hnRNP A2/B1基因表达之间无统计学意义(χ2＝0.515,P＞0.05);同样Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组血液与组织中检测hnRNP A2/B1基因表达差别无统计学意义(χ2＝0.444,P＞0.05)。

表4 三组肺组织hnRNP A2/B1的基因检测结果比较

表5 吸烟因素肺组织hnRNP A2/B1的基因检测结果比较

图1 总RNA电泳图

图2 血液标本的β-actin电泳图

图3 血液阳性标本电泳图(在280bp处可见阳性条带)

3 讨论

HnRNP是一组核内RNA结合蛋白，由30多个蛋白质小分子构成复合体,其主要功能与RNA转录、外显子剪接、剪接位点选择以及Pre-mRNA的成熟和降解有关[3]。hnRNP A2/B1是hnRNP的主要组成部分，它可在核内连接前RNA，并在RNA处理和连接位点的选择中起重要作用；此外，可在核与胞质间穿梭，具有将mRNA输出到胞质的功能；hnRNP还参与RNA的代谢、转录和DNA的复制[4-6]。hnRNP A2/B1在胚胎期正常肺发育的关键阶段过度表达，表达水平与肺癌及癌前病变类似，在正常发育的成熟肺组织中的表达被抑制；其在肺癌中的表达类似于胚胎肺发育关键期，这种表达在蛋白质和分子水平是一致的，表明hn-RNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白。近年来有研究表明hnRNP A2/B1表达异常与肺癌关系尤为密切[7-9]。本研究检测Ⅰ-Ⅱ期肺癌组、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌组及肺部良性病变三组样本外周血以及肺组织中hnRNP A2/B1的基因表达。结果表明在Ⅰ-Ⅱ期早期肺癌组与肺部良性病变组之间比较有统计学意义(P＜0.05)；Ⅰ-Ⅱ期肺癌组其肺组织hnRNP A2/B1表达与血液比较无统计学意义(P＞0.05)。分析可能由于肺癌早期肿瘤生长过程中组织细胞坏死后hnRNP A2/B1核酸释放入血，导致血浆的mRNA浓度升高；此外，肺组织血供非常丰富，肺癌早期血液中可能已出现了hnRNP A2/B1异常表达，这与一些文献报道相符[10，11]。由此看来，外周血hn-RNP A2/B1作为一种肿瘤标志物对早期非小细胞肺癌进行辅助诊断具有一定临床意义。

本研究将吸烟患者与非吸烟者比较，发现吸烟组外周血以及组织中hnRNP A2/B1的基因表达阳性率分别为67.65%和70.58%，明显高于不吸烟患组的35.14%和42.34%，两组率之间比较有统计学意义(P＜0.05)，这与Zhou的研究一致，推测吸烟可能为诱导机体hnRNP A2/B1基因表达上调的一个高危因素[12,13]。

在临床工作中，肺肿块切除术及肺肿块活检均为有创操作，且考虑到术后的肿瘤细胞可能种植扩散，要获取肺组织标本非常困难。外周血标本容易获取，而综合性医院临床检验中心RNA提取和RT-PCR技术实施也比较普遍。因此检测外周血hnRNP A2/B1的表达在非小细胞肺癌的早期诊断中有临床可行性，与其它肺癌相关指标联合应用将有助于肺癌临床早期诊断，争取早期救治，提高患者五年生存率。

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Diagnostic value of the peripheral blood hnRNP A2/B1 in NSCLC patients

LONG Yingying,GU Yan,LI Xi,et al.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To explore the value of detecting hnRNP A2/B1 in peripheral blood of non-small cell lung cancer，and to analyze the effects of smoking on the expression of hnRNP A2/B1 in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods A total of 71 patients were excised lung mass in our hospital from January 2009 to June 2012,who were divided into three groups:17 patients with lung cancer in stageⅠ-Ⅱ，24 patients with lung cancer in stageⅢ-Ⅳand 30 patients with pulmonary benign lesions. There were 34 patients in smoking group and 37 were in non-smoking group.HnRNP A2/B1 mRNA was extracted from peripheral blood and lung tissue.The hnRNP A2/B1 mRNA expression was analyzed with RT-PCR technology,and the three groups of patients were compared with hnRNP A2/B1 mRNA in peripheral blood and diseased lung tissue;and influence of smoking on peripheral blood and lung tissue hnRNP A2/B1 expression was analyzed.Results The expression of hnRNP A2/B1 was no significant difference between the peripheral blood and the cancer tissue in the patients of lung cancer(P＞0.05).The expression of hnRNP A2/ B1 in patients with NSCLC was markedly higher than that in patients with pulmonary benign lesions(P＜0.01).The hnRNP A2/B1 in the smoking group was higher than that in the non-smoking group(P＜0.05).Conclusion Detection of peripheral blood hnRNP A2/ B1 is a valuable way of diagnosis on NSCLC.Smoking is a high risk factor on the upregulation of expression of hnRNP A2/B1 in human.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1；NSCLC；Smoking

R734.2

A

1674-1129(2013)03-0217-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.006

江西省自然科学基金项目编号(00183781511219043)江西省卫生厅课题项目编号(20121188)

龙颖颖,男，38岁,毕业于南昌大学医学院，硕士，研究方

向肺癌的多耐药性。