结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药情况分析

李宁，伍严安，胡辛兰，吴长生

(福建省立医院检验科，福建福州350001)

结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药情况分析

李宁，伍严安，胡辛兰，吴长生

(福建省立医院检验科，福建福州350001)

目的比较结核分枝杆菌的3种实验室检测方法,了解出国体检人群结核分枝杆菌的检出率及耐药情况。方法收集2010年1月至2012年12月福建省立医院出国体检中心1030例疑似结核病患者的3090份标本的涂片镜检，罗氏固体培养，MGIT 960液体培养等3种实验室检测方法的结果，并对药敏情况进行分析。结果3种方法中，涂片镜检法检测时间最短(2h)，但阳性率最低(2.0%)；罗氏固体培养阳性检测时间最长(21.4d)，阳性率为7.1%，污染率2.1%；MGIT 960液体培养阳性检测时间为11.2d，阳性率为9.2%，污染率4.3%。106株结核分枝杆菌中，74株对5种抗结核一线药物全部敏感，耐吡嗪酰胺(PZA)的有25株，耐异烟肼(INH)的有13株，耐链霉素(SM)的有9株，耐利福平(RFP)的有4株，没有出现耐乙胺丁醇(EMB)的菌株。结论结核分枝杆菌的实验室检测方法中，MGIT 960液体培养时间较短，阳性率最高。在5种抗结核一线药物中，对PZA的耐药率最高，其次是INH。

结核病；分枝杆菌属；检测；评价；耐药性

被称为白色瘟疫的结核病是一种严重威胁人类健康的传染病。据WHO的最新报告，2010年有大约880万例新发结核病，145万例死于结核病[1]。结核病诊断的理想方法应是快速、特异、敏感，广大地区和人群可以接受，能辨别结核分枝杆菌和环境中的非结核分枝杆菌，且不需昂贵仪器和专业培训的方法[2]。目前，国内结核病主要的实验检测方法包括涂片镜检法、罗氏固体培养法、液体培养法、PCR基因检测法等，其中涂片镜检和分枝杆菌的培养是结核病临床诊断与鉴别的金标准[3]。提高结核病的检测速度，缩短药敏结果的报告时间，对于结核病的早期诊断和合理用药具有重要意义。福建省立医院是福建省最大的综合性医院，同时担负着美国、加拿大及澳洲出国人员结核病的筛查、诊断及治疗任务。笔者收集了2010年1月至2012年12月福建省立医院出国体检中心1030例疑似结核病患者的3090份标本的结核菌的涂片、培养和药敏结果，现分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料福建省立医院2010年1月至2012年12月出国体检中心1030例疑似结核病患者的3090份痰标本(每位患者都连续送3次)，其中男性患者575例，女性患者455例。

1.2 仪器和试剂BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养仪，由美国BD公司生产，其配套试剂包括分枝杆菌液体培养管(MGIT培养管)、生长添加剂、杂菌抑制剂(PANTA)、分枝杆菌联合药敏试剂盒(SIRE kit)和PZA药敏试剂盒。化学发光检测仪LEADER 50I、AccuProbe探针检测试剂盒及罗氏培养基由梅里埃公司生产。Mtb抗原检测试剂(胶体金法)由杭州创新生物检验技术公司生产。抗酸染液、革兰染液购自贝索公司。标本前处理液：4%N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠(4%NALCNaOH)，pH6.8磷酸盐缓冲液。

1.3 方法

1.3.1 标本前处理步骤按BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统操作指南完成，取沉渣0.5ml接种于MGIT培养管，同时取沉渣0.2ml接种于中性罗氏培养基，并进行涂片，待涂片自然干燥后进行抗酸染色，统计其初始涂片阳性率。

1.3.2 药敏试验采用比例法，药敏操作按照BACTEC MGIT 960操作指南完成。BACTEC MGIT 960能进行链霉素(SM)、异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)五种一线抗结核药物的敏感性实验，药物终浓度分别为1.0、0.1、1.0、5.0和100μg/ml。药敏质量控制菌株为H37RV。

1.3.3 检出阳性结果的处理BACTEC MGIT 960仪器报告阳性后，取出阳性培养管，做两张涂片，分别行抗酸染色和革兰染色。若抗酸染色阳性，视为分枝杆菌生长；若抗酸染色阴性，需再行普通细菌培养和革兰染色，确定是否有其它细菌或真菌生长，若有即视为标本污染。中性罗氏培养基置于37℃温箱中孵育，每周观察两次，若发现可疑菌落，处理及判断同BACTEC MGIT 960培养。BACTEC MGIT 960培养周期为42d，超过42d未报阳视为阴性；中性罗氏培养基培养周期为56d，超过56d未报阳视为阴性。

1.3.4 菌型鉴定若涂片证实为分枝杆菌生长，即取培养管中的培养物100μl，加于胶体金检测条中，15min后观察结果，阳性说明为结核分枝杆菌。同时用Gen-Probe分子生物学诊断的AccuProbe探针检测试剂盒，完成结核与非结核分枝杆菌的检测和鉴定。

1.3.5 药敏结果判读联合药敏SM、INH、RFP和EMB 4种药物共用1个生长对照管，对照管作1: 100稀释。PZA药敏采用PZA专用培养管，对照管作1:10稀释。当生长对照管的生长单位(GU)≥400时，评价含药物的培养管，如果含药物的培养管GU≥100，则结果判为耐药，如果GU＜100，则结果判为敏感。

2 结果

2.1 结核菌3种实验诊断方法的平均时间、阳性率和污染率的比较，见表1。

表1 结核菌3种实验诊断方法的平均时间、阳性率和污染率比较

2.2 106株结核菌药敏结果见表2。

表2 106株结核菌药敏结果

3 讨论

分枝杆菌是一类抗酸阳性的细长略带弯曲的杆菌，有时呈分枝状。根据致病性的不同，分为结核分枝杆菌群和非结核分枝杆菌群。结核分枝杆菌是结核病的病原菌，能够导致进行性疾病和无症状的潜伏感染。本菌可侵犯全身各组织器官，以肺部感染最为多见。目前检测分枝杆菌的方法有涂片镜检法、罗氏固体培养法、液体培养法和PCR检测法等。其中，分枝杆菌的涂片镜检与培养是结核病诊断的金标准。

涂片镜检法方法快速简单，但敏感性较低，痰标本含菌量达104/ml方能检出[4]。从表1可以看出，涂片镜检虽然所用时间最短，但阳性率仅达到2%，明显低于固体培养的7.1%和液体培养的9.2%。涂片镜检法的阳性率与标本的质量密切相关，且一般要求连续送检3d，以提高检出率。另外，涂片镜检法无法开展菌型鉴定及药敏试验，因此有很大的局限性。

由于分枝杆菌生长速度缓慢，18h分裂一次，故分枝杆菌的培养时间较长。分枝杆菌的培养基有改良的罗氏固体培养基和液体培养基。从表1可以看出，液体培养的时间比固体培养的时间明显缩短，但液体培养需要昂贵的仪器设备，基层医院很难开展。液体培养的阳性率高于固体培养，但污染率相对较高，这可能与前处理液中的氢氧化钠浓度有关。

固体或液体培养基培养出分枝杆菌后，必须对培养物进行进一步的菌型鉴定。目前我院采用的是简便快速的胶体金法，同时用通过美国FDA认证的Gen-Probe分子生物学诊断的AccuProbe探针检测法进行验证。283株分枝杆菌的菌型鉴定结果显示，结核分枝杆菌占152株，非结核分枝杆菌占131株。胶体金法和AccuProbe探针检测法的符合率为100%。胶体金法方便快捷，结果准确，可以作为结核菌菌型鉴定的首选方法。

经胶体金法和AccuProbe探针检测法的联合检测，我院对检出的152株结核分枝杆菌中的106株(剔除了重复菌株)进行了药敏实验，结果显示：106株结核分枝杆菌中，对5种抗结核一线药物全敏感的有74株，占69.8%；耐药的有32株，占30.2%，低于国家调查公布的46%的全国平均耐药水平[5]。其中耐PZA的比例最高，达到23.6%，高于昆明苏俊华等人报告的10.1%[6]。其次是INH,占12.3%，EMB的敏感性最好，耐药率为0。对MDRTB也做了统计，仅占2.8%，比例较低，这可能与受检群体为疑似结核的出国体检人员有关，这些患者一般都是首次发现，大部分还没有经过治疗。

通过对疑似结核的出国体检人员的结核分枝杆菌培养的各项数据的统计分析，我们对这一群体的阳性检出率及药敏耐药率等有了初步的了解，积累了一定的经验，这对出国体检人员这一群体结核病的检出与防治具有重要意义。

[1]Global Tuberculosis control:WHO report 2011[EB/OL].2011.http:// www.who.int/tb/publications/global-report/en.

[2]Rosenkrands I,Aagaard C,Weldingh K,et al.Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis[J].Tuberculosis,2008,88(4):335-343.

[3]张思潮,邱志红,陆惠勤.不同痰液标本肺结核杆菌培养结果比较[J].浙江预防医学,2008,20(1):59．

[4]熊礼宽.结核病实验诊断学[M].北京:人民卫生出版社,2003：92-135.

[5]叶莺,严延生.耐多药结核病的流行概况[J].疾病控制杂志,2008,13 (1):63-65.

[6]苏俊华,梁桂亮,保凌.昆明地区结核分枝杆菌标本培养检测及耐药情况分析[J].中国防涝杂志,2012,34(1):32-35.

Evaluation of three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analysis of drug resistance in isolates

LI Ning,WU Yanan,Hu Xinlan,et al.Department of Clinical Laboratory,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China

Objective To compare three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analyze the distribution and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolated from personnel going abroad.Methods The results of 3090 samples from 1030 personnel going abroad with suspected tuberculosis in Fujian provincial hospital from 2010 to 2012 were collected and analyzed,which were detected by smear-microscopy method,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method.The results of the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis were analyzed too.Results Among the smear-microscopy,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method,the detection times of them were 2 hours,21.4 days and 11.2 days respectively;the positive rates of them were 2.0%,7.1%and 9.2%respectively,the contamination rates of Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method were 2.1%and 4.3%respectively.In total 106 strains of Mycobacterium tuberculosis,the number of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide,Isoniazid,Streptomycin and Rifampin were 25,13,9 and 4,respectively;all strains were sensitive to Ethambutol;and 74 strains were sensitive to all five drugs.Conclusions Among three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis,the MGIT 960 liquid culture method is the best,which spends the least time and has the highest positive rate.Among five mainly used anti-tuberculosis first-line drugs,the top two levels of drug resistance to Mycobacterium tuberculosis were Pyrazinamide and Isoniazid.

Tuberculosis;Mycobacterium;Detection;Evaluation;Drug resistance

R446.5，Q939.92，R378.91+1，R52

A

1674-1129(2013)03-0214-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.005

李宁，女，1974年12月出生，毕业于福建医科大学检验系，学士学位。主管技师，从事临床微生物的检验与研究。