低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7侵袭抑制实验研究

庞 新，王 鹏

（1.河北省保定市第三医院普内科，河北保定071000；2.河北省保定市第二医院肿瘤内科，河北保定071000）

·论 著·

低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7侵袭抑制实验研究

庞 新1，王 鹏2

（1.河北省保定市第三医院普内科，河北保定071000；2.河北省保定市第二医院肿瘤内科，河北保定071000）

目的探讨低分子肝素（lowmolecularweightheparin，LMWH）抑制人乳腺癌细胞MCF-7的侵袭作用及其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测LMWH素对人乳腺癌细胞MCF-7黏附的影响，采用Transwell小室法检测LMWH对该细胞的迁移、侵袭的抑制作用，采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法半定量检测LMWH处理细胞24h后组织因子（tissue factor，TF）mRNA的表达水平。结果MTT比色法分析检测显示，LMWH对MCF-7细胞与细胞外基质成分Matrigel黏附力的抑制作用呈剂量效应依赖关系。迁移和侵袭实验显示，LMWH对MCF-7细胞的迁移和侵袭抑制均呈剂量-效应依赖关系。半定量RT-PCR检测结果显示，LMWH处理后MCF-7细胞TFmRNA表达水平较对照组明显降低。结论LMWH可通过下调TFmRNA表达水平抑制人乳腺癌细胞MCF-7黏附、迁移、侵袭。

乳腺肿瘤；肝素，低分子量；肿瘤转移

侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，作为女性高发的恶性肿瘤，乳腺癌在早期即可出现全身转移。因此，对乳腺癌侵袭和转移的防治成为肿瘤研究的热点。肝素类化合物在抑制恶性肿瘤侵袭、转移中的作用已得到证实，但机制尚未完全明确。本研究探讨低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）对乳腺癌细胞侵袭和转移的影响和作用机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与来源：人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海细胞所。低分子肝素（法玛西亚普强德

国有限公司）；RPMI-1640培养基、胰蛋白酶（美国GIBCOL公司）；胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）（北京华美生物工程公司）；TrizolTMReagent、Oligo（dT）15 Primer、AMV Reverse Transcriptase Go Tap Green Master Mix（美国Promega公司）；Matrigel（美国BD公司）；Transwell小室和24孔板（美国Corning公司）；PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.2 细胞培养及制备细胞悬液：将MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的恒温培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.3 黏附实验测定黏附抑制率：96孔板每孔用Matrigel 30μL包被、2％牛血清白蛋白（bovine serum aibumin，BSA）封板，每组设3个复孔。用不同浓度（0、25、50、100U/mL）LMWH处理MCF-7细胞24h后，胰酶消化、PBS洗涤，制成5×105个/mL细胞悬液，200μL/孔加入96孔板内。于恒温培养箱内，分别孵育60、90、120min弃去各孔培养液，PBS冲洗除去未黏附的细胞。加无血清RPMI-1640 200μL/孔，MTT溶液20μL/孔，孵育4h。弃MTT液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL/孔，溶解振荡10min，自动酶标仪570nm波长下测各孔A570值，计算细胞黏附抑制率。黏附抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100％。

1.4 体外侵袭实验：将Transwell置于24孔板内，在小室上室面底部聚碳酯膜上均匀铺上1∶5 RPMI1640稀释的Matrigel 40μL/孔，成胶30min后，置超净台紫外灯照射过夜。实验前再次成胶，设对照组及处理组（25、50、100U/mL浓度LMWH处理24h）细胞，调整浓度为10.0×105/mL的细胞悬液200μL接种到成胶的Transwell小室内。在24孔板内（小室下层）加600μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养24h。取出小室擦掉Matrigel，冲洗，固定，HE染色。揭下聚碳酯膜反贴在载玻片上，树胶封片，在光镜（×200）下，每个膜随机选取上、下、左、右、中心5个视野，计数穿膜细胞数，计算细胞侵袭抑制率。侵袭抑制率=（对照组细胞侵袭数-处理组细胞侵袭数）/对照组细胞侵袭数× 100％。

1.5 迁移实验：内聚碳酯滤膜表面不铺Matrigel，后继步骤与侵袭实验相同。通过计数穿过膜的细胞数反映细胞的运动能力。计算细胞迁移抑制率。迁移抑制率=（对照组细胞迁移数-处理组细胞迁移数）/对照组细胞迁移数×100％。

1.6 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）半定量检测MCF-7细胞因子（tissua factor，TF）mRNA的表达水平：取对数生长期细胞，设置溶剂对照组和处理组（25、50、100U/mL浓度LMWH处理24h）。分别提取细胞总RNA。调整总RNA浓度为1μg/μL。取总RNA 2μL，进行逆转录。逆转录反应条件，70℃10min，25℃1min，42℃60min（cDNA合成），94℃5min。然后以该cDNA为模板进行PCR反应，βactin引物序列，5'-GTGGGGCGCCCC-AGGCACCA-3'（sence），5'-CTCCTTAATTAATGTCA-CGCACGATTTC-3'（anti-sence），扩增片段长度为517bp，退火温度60℃，30个循环。TF引物序列，5'-TACGAGGCTTTATGAGTAAAC-3'（sence），5'-GCCTGGGCAACAGAGCAA-3'（anti-sence），扩增片段长度为356bp，退火温度60℃，30个循环。

扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳30min，以DNAMarker作为标准分子量标记，电泳后于紫外透射仪观察，应用美国FOTODYNE凝胶成像分析系统对目的电泳条带进行分析。

1.7 统计学方法：应用SPSS14.0统计软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黏附抑制率：不同浓度LMWH（25、50、100U/mL）处理细胞60～120min后，与对照组相比，各处理组OD值均有不同程度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。60、90、120min黏附抑制率分别为13.88％、30.18％、42.51％，13.70％、26.51％、44.43％，17.75％、32.47％、48.20％，细胞的黏附抑制率均有随药物浓度增大而增高的趋势。见表1。表明25～100U/mL浓度LMWH对MCF-7细胞的黏附能力均有明显的抑制作用。

2.2 LMWH对MCF-7细胞侵袭力的影响：不同浓度（25、50、100U/mL）的LMWH处理24h后，与对照组相比，各处理组细胞侵袭数均有不同程度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞侵袭抑制率分别为24.67％、50.49％、84.15％。见表2。表明25～100U/mL浓度LMWH对MCF-7细胞的侵袭能力均有明显的抑制作用。

表1 LMWH对MCF-7细胞黏附能力的影响Table 1 Effect of LMWH on adhesive ability of MCF-7 cells（n=3，±s，OD）

表1 LMWH对MCF-7细胞黏附能力的影响Table 1 Effect of LMWH on adhesive ability of MCF-7 cells（n=3，±s，OD）

*P＜0.05 vs 0U/mL group #P＜0.05 vs 25U/mL △P＜0.05 vs 50U/mL by ANOVA test

Groups（U/mL）Adhesive ability ofMCF-7 cells 60min 90min 120min 0 0.454±0.061 0.664±0.035 0.890±0.018 25 0.391±0.056*0.573±0.064*0.732±0.029*50 0.317±0.023*#0.488±0.074*#0.601±0.062*#100 0.261±0.022*#△0.369±0.023*#△0.461±0.045*#△

表2 LMWH对MCF-7细胞侵袭力的影响Table 2 Effect of LMWH on invasive ability of MCF-7 cells

2.3 LMWH对MCF-7细胞运动能力的影响：不同浓度（25、50、100U/mL）的LMWH处理24h后，与对照组相比，各处理组细胞迁移数均有不同程度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞迁移抑制率分别为23.12％、36.95％、58.78％。见表3。表明25～100U/mL浓度LMWH对MCF-7细胞的运动能力均有明显的抑制作用。

表3 LMWH对MCF-7细胞运动能力的影响Tab le 3 Effect of LMWH on m igrative ability of MCF-7 cells

2.4 半定量RT-PCR法检测LMWH对MCF-7细胞TFmRNA表达的影响：经25、50、100U/mL LMWH作用MCF-7细胞24h后，TFmRNA的表达水平随处理浓度增大而逐渐减弱。药物处理前MCF-7细胞TF/β-actin比值为0.591±0.035，当LMWH处理24h后MCF-7细胞的TF/β-actin比值分别为0.369±0.038、0.276±0.015、0.190±0.002，作用前后差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

侵袭和转移是恶性肿瘤的标志，是其致死的主要原因。肿瘤侵袭转移是一个连续、渐进的多步骤动态过程，包括黏附、运动、增殖、基质降解以及新生血管形成等多步骤信号级联反应。研究［1］发现，LMWH能进入某些恶性肿瘤细胞内部而抑制肿瘤生长和有关基因的表达。Marchetti等［2］研究证明，LMWH能够显著抑制乳腺癌和白血病中多种细胞因子诱导的毛细血管形成作用。

本研究结果显示浓度在0～100U/mL之间时，随着LMWH浓度的增高，对细胞侵袭的抑制能力逐渐增加。MCF-7细胞侵袭能力的下降可能是其黏附能力和运动能力下降共同作用的结果。本研究黏附实验和迁移实验中证实了这一点，并发现LMWH抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭、转移与下调其TF基因表达有关。

TF即凝血因子Ⅲ，为单链跨膜糖蛋白，属于细胞因子超家族成员，是生理性止、凝血过程及多种病理性血栓形成的启动因子。研究［3-5］已证实在结直肠癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌中，TF表达水平与其恶性程度、临床分期和预后密切相关。

在浸润性乳腺癌中存在TF高表达的成肌纤维细胞围绕在肿瘤细胞周围，这些表达TF的细胞与细胞外基质改变常同时出现［6］，提示其与肿瘤的侵袭性密切相关。Ueno等［7］认为乳腺癌中TF的表达可作为预计生存期的独立预后因素，可对评价乳腺癌患者的远期转移和复发提供有效的前瞻性价值。杨莉等［8］研究也发现乳腺癌有淋巴结转移患者TF表达高于无转移患者，并且TF表达越强，淋巴结转移可能性越大，预后越差。表明TF有明显促进乳腺癌细胞侵袭转移的作用。Poon等［9］认为TF促进肿瘤细胞侵袭转移的原因，是促进肿瘤血管的生成并影响细胞间黏附和细胞外基质降解。肿瘤细胞的TF表达与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达、微血管密度（microvessel density，MVD）呈正相关。特别是TF分子胞内区末端3个丝氨酸残基磷酸化具有细胞内信号传导功能，能促进VEGF的转录和合成，而VEGF也可促进TF的表达，TF—VEGF—TF这种正反馈的调节机制促进了肿瘤的生长和血管的形成的恶性循环过程。TF上调的白细胞介素1、白细胞介素8也有强烈诱导血管生成作用。肝素类化合物可抑制TF的表达，而LMWH对TF的抑制作用强于普通未分级肝素（unfractionated heparin，UFH），有更强的抑制新生血管的作用。刘飞等［10］研究证实，通过LMWH的干预，裸鼠MCF-7移植瘤中VEGF的活性显著被抑制，MVD值明显下降。

同时，表达TF的肿瘤细胞与重组FⅦa或抗TF

抗体结合后通过肌动蛋白的多聚产生细胞内的信号传导上调基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）表达。这些蛋白酶的高表达破坏基质的降解平衡，促进肿瘤细胞突破基底膜和细胞外基质构成的组织化学屏障，侵袭周围组织并转移至远处。LMWH不仅通过抑制TF表达下调部分MMPs，其自身所带的负电荷也抑制了MMPs的活性。

TF与肿瘤之间的关系及相互作用的机制仍值得进一步探讨。但TF在肿瘤生长、侵袭、转移中的活跃作用使之成为肿瘤治疗中极具吸引力的靶点。本研究发现LMWH能显著降低TF基因表达，抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭。此外，LMWH在体内还可通过促进组织因子旁路抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）释放抑制肿瘤部位新生血管生成［11］。这可能是LMWH在体内抑制TF的另一种途径。体外实验虽然不能真正模拟体内乳腺癌侵袭和转移的器官微环境和转移效果，但是能在一定程度上反映LMWH对乳腺癌细胞的运动和侵袭能力的影响，为预防乳腺癌生长、浸润、转移提供了新的、有益的借鉴。

［1］林义佳，徐建波，张常华.低分子肝素抑制肿瘤转移的研究进展［J］.国际外科学杂志，2009，36（4）：253-255.

［2］MARCHETTI M，VIGNOLI A，RUSSO L，et al.Endothelial capillary tube formafon and cell proliferation induced by tumor cells are affected by low molecular weight heparins and unfractionated heparin［J］.Thromb Res，2008，121（5）：637-645.

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［8］杨莉，侯意见，胡晶莹，等.组织因子TF在乳腺癌中的表达及其临床意义［J］.肿瘤，2003，23（4）：326-328.

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［10］刘飞，李汉军，李介秋，等.低分子肝素对种植性乳腺癌生长和转移的抑制作用的研究［J］.中华实验外科杂志，2010，27（1）：50-52.

［11］MOUSA SA，MOHAMED S.Anti-angiogenic mechanisms and efficacy of the low molecular weight heparin，tinzaparin：anticancer efficacy［J］.Oncol Rev，2004，12（4）：683-688.

（本文编辑：赵丽洁）

EFFECTSOF LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARIN ON INVASIVENESS OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINE MCF-7 ABSTRACT

PANG Xin1，WANG Peng2
（1.Department of Internal Medicine，the Third Hospital of Baoding，Hebei Province，Baoding 071000，China；2.Department of Medical Oncology，the Second Hospital of Baoding，Hebei Province，Baoding 071000，China）

Objective To study the effects of low molecular weight heparin（LMWH）on invasiveness of human breast cancer cell line MCF-7 and itsmechanisms.MethodsTetrzolium-based colorimetric assay（MTT）colorimetricmethod was used to detect the effect of LMWH on the adhesion of human breast cancer cellline MCF-7.The expression of tissue factor（TF）mRNA was semiquantitatively detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）in MCF-7 cells after being treated with LMWH for 24h.ResultsLMWH inhibited the adhesion of MCF-7 cells significantly in a dosedependentmanner.LMWH inhibited the invasive and metastatic abilities of MCF-7 cells significantly in a dose-dependentmanner.The results of RT-PCR showed that the expression of TFmRNA decreased after LMWH treatment for 24h compared to that of control group.ConclusionLMWH inhibited the adhesive，metastatic and invasive abilities of MCF-7 cells by down-regulating the expression of TFmRNA.

breast neoplasms；heparin，low-molecular-weight；neoplasm metastasis

R737.9

A

1007-3205（2013）06-0657-04

2012-10-24；

2013-12-16

庞新（1978-），女，河北清苑人，河北省保定市第三医院主治医师，医学硕士，从事消化内科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.014