基质金属蛋白酶2的表达及其与胃癌临床生物学行为和预后的关系

郝英杰，羡 鲜，李 勇*，范立侨，焦志凯，张志栋

（1.河北医科大学第四医院外三科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院病原生物学教研室，河北石家庄050017）

·论 著·

基质金属蛋白酶2的表达及其与胃癌临床生物学行为和预后的关系

郝英杰1，羡 鲜2，李 勇1*，范立侨1，焦志凯1，张志栋1

（1.河北医科大学第四医院外三科，河北石家庄050011；2.河北医科大学基础医学院病原生物学教研室，河北石家庄050017）

目的探讨在胃癌组织、胃癌区域淋巴结及正常胃黏膜中基质金属蛋白酶2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）的表达情况，分析其与胃癌临床生物学行为、侵袭转移能力及预后的关系。方法选取行胃癌根治术并经病理证实的胃癌标本96例，胃癌区域淋巴结96例，正常胃黏膜60例，全部病例均随访5年以上。应用免疫组织化学方法检测上述标本中MMP-2的表达情况。结果胃癌组织中MMP-2的阳性表达率明显高于正常胃黏膜，并随分化程度的降低、浸润深度的加深表达增加，随临床分期的增加、淋巴结的转移而明显增强（P＜0.05或P＜0.01）。胃癌区域淋巴结组织中，有转移淋巴结组MMP-2的阳性表达率明显高于无转移淋巴结组（P＜0.01）。胃癌患者生存期≥5年组MMP-2表达阳性率明显低于生存期＜5年组（P＜0.01）。结论MMP-2的表达差异与胃癌的侵袭转移及预后关系密切。检测MMP-2对胃癌侵袭转移的预测、预后评估及指导合理的综合治疗等具有重要的临床意义。

胃肿瘤；基质金属蛋白酶2；免疫组织化学

胃癌的侵袭和转移是影响患者预后的主要因素。临床上有约60％肿瘤患者虽然经过有效的治疗，但最终还是死于复发转移。胃癌的侵袭和转移是多因素协调作用的结果，其中细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的降解被认为是肿瘤侵袭和转移的早期信号。作为降解ECM成分最重要的酶——基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs），在这一过程中起着非常重要的作用［1］。其中MMP-2，即Ⅳ型胶原酶，在肿瘤细胞介导的细胞外基质的降解过程中起关键作用，其与肿瘤侵袭和转移的关系是近年来胃癌研究的热点，并已成为新的抗肿瘤药物作用的靶点。本研究应用免疫组织化学（SP）法对正常胃黏膜、胃癌组织及区域淋巴结组织中MMP-2的表达水平进行检测，分析其表达与胃癌的临床生物学行为及预后的关系，以探讨MMP-2在胃癌侵袭和转移中的作用，为预测胃癌的侵袭转移、预后评估及合理的综合治疗等提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2003年9月—2005年5月于河北医科大学第四医院外三科行胃癌根治术并经病理证实的患者，男性70例，女性26例，年龄28～75岁，平均（56.0±10.6）岁，取胃癌组织96例，胃癌区域淋巴结96例，正常胃黏膜60例，所有胃癌临床记录均按“全国胃癌诊治规范”进行登记。病理诊断结果均经2名以上病理主治医师确认，术前均未接受放疗和化疗，临床病历资料完整。全部病例均随访5年以上。

1.2 方法

1.2.1 临床及病理资料分组：按“全国胃癌诊治规范”进行分组，分析不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、Borrmann分型、分化程度、浸润深度、临床分期、淋巴结转移和生存期的MMP-2表达情况。

1.2.2 主要试剂：一抗，鼠抗人MMP-2单克隆抗体，均购自福州迈新生物技术开发公司。免疫组织化学染色试剂盒，封闭用正常山羊血清，生物素标记二抗IgG，辣根酶标记链酶卵白素工作液，均为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。

1.2.3 免疫组织化学染色方法：取手术切除的胃癌组织、区域淋巴结组织及正常胃黏膜组织标本放入10％中性缓冲福尔马林液中固定24h，常规石蜡包埋，行4μm连续切片，一式3份，每例取一张作常规病理组织检查（HE染色），进行病理学分析，其余2张进行免疫组织化学染色。应用过氧化物酶标记的链霉素染色进行免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡，3％H2O2去离子水封闭内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗、浸泡后置于枸橼酸盐缓冲液内加热至98℃20min进行抗原修复。羊血清封闭10min，切片滴加一抗后37℃孵育60min，PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗，37℃孵育20min。PBS冲洗后滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育20min。PBS冲洗后，苏木素复染、脱水、中性树脂封片，镜下观察结果。

1.2.4 检查结果判断：用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照。染色结果判定以肿瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，高倍镜下取4个视野各计数200个细胞，按阳性细胞所占百分比将染色结果分为阳性细胞＜5％为（-），阳性细胞5％～25％为（+），阳性细胞＞25％～50％为（++），阳性细胞＞50％为（++ +）。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常胃黏膜、胃癌组织、区域淋巴结中MMP-2表达：正常胃黏膜组织（图1）60例。胃癌组织（图2）96例，其中高中分化腺癌58例，可见癌细胞呈大腺管状或乳头状；低分化腺癌38例，可见癌细胞

排列无明显腺管。胃癌区域淋巴结96例，其中无转移淋巴结（图3）42例，淋巴结组织内未见转移灶；有转移淋巴结（图4）54例，淋巴结组织内可见转移癌灶。MMP-2在正常胃黏膜中的表达主要表现为阴性或弱阳性（图5）。在胃癌组织及淋巴节转移癌组织中MMP-2的表达均位于肿瘤细胞的胞浆内，为胞浆内散在或弥漫性分布的粗细不等的棕黄色颗粒，未见胞核着色（图6，7）。在无转移淋巴结中MMP-2的表达主要表现为阴性或弱阳性（图8）。正常胃黏膜中MMP-2表达的阳性率为43.3％，胃癌组织中MMP-2的阳性表达率为66.7％，明显较正常胃黏膜的表达增高，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。胃癌区域淋巴结组织中，无转移淋巴结组MMP-2的表达阳性率为2.4％，有胃癌转移的淋巴结组MMP-2的表达阳性率为63.0％，明显高于无转移淋巴结组MMP-2的表达，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表1 胃癌组织与正常胃黏膜组织中MMP-2的表达Table 1 Expression of MMP-2 in gastric carcinoma tissues and normalgastric mucosa（n，％）

表2 胃癌区域淋巴结组织中MMP-2的表达Table 2 Expression of MMP-2 in gastric regional lymph node tissues（n，％）

2.2 胃癌组织中MMP-2表达与其临床生物学行为之间的关系：在不同性别、年龄、肿瘤部位、大小及Borrmann分型胃癌组织中MMP-2阳性表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。低分化组较高中度分化组MMP-2表达阳性率高、浸润深度T3+T4组较T1+ T2组MMP-2表达阳性率高、临床分期Ⅲ～Ⅳ组较Ⅰ～Ⅱ组MMP-2表达阳性率高、有淋巴结转移组较无淋巴结转移组MMP-2表达阳性率高、生存期＜5组较≥5年组MMP-2表达阳性率高（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表3 胃癌组织中MMP-2表达与其临床生物学行为之间的关系Table 3 Expression of MMP-2 in gastric carcinoma tissues and clinicalbiological characteristics in patients w ith gastric carcinoma（n，％）

3 讨 论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要特征之一，也是引起治疗失败的主要原因。肿瘤的侵袭和转移是经多步骤发生的结果，基底膜降解、穿透循环到达血管外、侵袭靶器官和形成转移的特征，涉及增殖、迁移、蛋白溶解和血管生成等过程［2］。其中，ECM的分解被认为是浸润和转移的早期信号，ECM的降解及基底膜的破坏需要MMPs来完成。MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，可以降解ECM和基底膜成分以及一些非基质成分，从而改变肿瘤细胞的微环境，促进肿瘤的侵袭和转移。MMPs与肿瘤侵袭和转移的关系已成为新的抗肿瘤药物作用的靶点，也是近年来肿瘤侵袭和转移研究的热点。MMPs产生于正常组

织细胞（结缔组织细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、胸腺细胞等）和肿瘤细胞中，以酶原形式分泌。其中MMP-2即明胶酶A是MMPs家族中的重要成员，它的主要水解底物是变性胶原、Ⅳ型胶原等，还可以分解糖蛋白成分纤维连接蛋白和层黏连蛋白［3］，且与肿瘤的侵袭和转移有关。MMP-2与肿瘤侵袭和转移的关系已在头颈部肿瘤、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌［4-7］等的研究中得到证实。胃癌作为我国最常见的恶性肿瘤之一，其高侵袭和转移的特性是影响患者预后的主要因素，及时诊断并阻止其侵袭转移是当前研究的热点和难点。MMP-2作为ECM的主要降解酶，参与ECM的降解过程，研究MMP-2在胃癌患者组织中的表达，揭示其生物学特性，对探究胃癌的侵袭和转移具有非常重要的意义。本研究采用免疫组织化学方法（SP）检测MMP-2在胃癌组织、区域淋巴结组织及正常胃黏膜中的表达，分析其与肿瘤侵袭转移的能力、胃癌临床生物学行为及预后的关系。旨在寻找特异性较好的指标，为胃癌侵袭转移的预测、预后评估及合理的综合治疗等提供有力的理论依据。

本研究结果显示，胃癌组织中MMP-2的阳性表达率为66.7％，正常胃黏膜中MMP-2的阳性表达率为43.3％，胃癌组织中的MMP-2的阳性表达率较正常胃黏膜明显增高（P＜0.01）。与文献报道一致［8］。说明胃癌发生后，MMP-2表达增强，具备了侵袭转移的能力。胃癌的临床生物学行为与患者的预后有关，尤其是肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期等。MMP-2的过表达已被证实与胃癌的侵袭转移密切相关［9］。近年来体外实验［10］也证实，MMP-2也可以调节胃癌细胞的侵袭能力，低分化癌细胞MMP-2表达的阳性率显著高于高中分化者，进展期胃癌MMP-2的阳性表达率高于早期胃癌。

本研究结果显示，胃癌组织中MMP-2表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、大小和Borrmann分型均无关（P＞0.05）；但在分化程度中，低分化组阳性表达率较高中分化组明显增高；浸润深度中，T3+T4组阳性表达率较T1+T2组明显增高；临床分期中，Ⅲ～Ⅳ组阳性表达率较Ⅰ～Ⅱ组明显增高；有淋巴结转移组阳性表达率较无淋巴结转移组明显增高（P＜0.05或P＜0.01）。本研究还发现，胃癌组织中MMP-2表达阳性率在生存期≥5年组为45.9％，在生存期＜5组为79.7％，MMP-2表达阳性率生存期≥5年组较＜5年组明显降低（P＜0.01）。分析其原因：在肿瘤发生侵袭和转移过程中，肿瘤细胞突破ECM是非常重要的步骤，而Ⅳ型胶原为ECM的组成成分之一，具有独特螺旋结构的蛋白质，只有Ⅳ型胶原酶能降解其成分，从而破坏ECM的完整性。Ⅳ型胶原酶有2种分子类型，相对分子质量为72 000的MMP-2和92 000的MMP-9。而在肿瘤侵袭和转移过程中MMP-2起着较MMP-9更为重要的作用。本研究表明，MMP-2随着胃癌分化程度的降低、浸润深度的加深、临床分期的增加、淋巴结的转移，其阳性表达率显著增高。说明胃癌侵袭转移能力逐渐增强，表达阳性者预后差，5年生存率明显降低；胃癌组织中MMP-2的表达与胃癌的侵袭转移程度及预后关系密切，是肿瘤恶性进展的标志。

淋巴结转移是胃癌转移的重要途径，亦是影响胃癌患者预后的重要因素。本研究结果显示，胃癌区域淋巴结组织中，按淋巴结转移情况分组，无转移淋巴结组MMP-2的表达阳性率为2.4％，有转移淋巴结组MMP-2的表达阳性率为63.0％，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。MMP-2表达阳性有利于甚至加强了胃癌的侵袭和转移，使患者预后较差。

综上所述，胃癌组织中MMP-2表达的失调与胃癌的侵袭转移及患者的预后有着十分密切的关系，是胃癌侵袭转移重要的分子学基础，其表达的上升意味着胃癌侵袭转移能力增强，患者预后较差。区域淋巴结组织中MMP-2表达的异常也与胃癌淋巴结转移关系密切，其表达率的上升加强了胃癌的侵袭和转移。因此，联合检测胃癌组织及区域淋巴结组织中MMP-2的表达对于预测胃癌侵袭转移的情况、患者预后评估及提出更合理的综合治疗方案具有十分重要的临床意义。（本文图见封二）

［1］ISHIBASHI Y，MATSUMOTO T，NIWA M，et al.CD147 and matrix metalloproteinase-2 protein expression as significant prognostic factors in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Cancer，2004，101（9）：1994-2000.

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［9］江州华，俞继卫，姜波健.基质金属蛋白酶对胃癌微环境调控作用的研究进展［J］.中国普外基础与临床杂志，2009，16（9）：768-772.

［10］SHEN L，LIU Z，TU Y，etal.Regulation ofMMP-2 expression and activity byβ-1，3-N-acetylglucosaminyltransferase-8 in AGS gastric cancer cells［J］.Mol Biol Rep，2011，38（3）：1541-1550.

（本文编辑：刘斯静）

EXPRESSION OF MATRIX METALLOPRTEINASE-2 AND ITSRELATIONSHIP W ITH BIOLOGICAL BEHAVIOR AND PROGNOSIS OF HUMAN GASTRIC CACNER

HAO YingJie1，XIAN Xian2，LIYong1*，FAN Liqiao1，JIAO Zhikai1，ZHANG Zhidong1
（1.Third Department of General Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang
050011，China；2.Department of Pathogen Biology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To evaluate the expression ofmatrix metalloproteinase-2（MMP-2）in human gastric cancer tissues，gastric regional lymph nodes and normal gastric mucosa tissues，analyze the relationship between its expression level and biological behavior，invasion and metastasis of human gastric cancer.MethodsSixty cases of normal gastric mucosa tissues，96 cases of pathologically confirmed gastric cancer specimens and 96 cases of gastric regional lymph nodeswere selected，and all patientswere followed up formore than five years.The immunohistochemicalmethod was used to detect the expression level of MMP-2 in different tissues.ResultsThe positive expression rate of MMP-2 in gastric cancer tissueswas significantly higher than that in normal gastric mucosa，and the expression was increased with the declined degree of differentiation and depth of invasion of tumors.The expression of MMP-2 was significantly enhanced with lymph node metastasis and clinical stage（P＜0.05 or P＜0.01）.MMP-2 expression of regional lymph nodes of gastric cancer was significantly higher in metastatic lymph node

stomach neoplasms；matrixmetalloproteinase 2；immunohistochemistry

R735.2

A

1007-3205（2013）06-0621-05

2012-09-04；

2013-01-28

郝英杰（1979-），男，河北深县人，河北医科大学第四医院主治医师，医学博士研究生，从事普通外科疾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.001

group than that of non-metastatic lymph node group（P＜0.01）.The MMP-2 expression in gastric carcinoma tissue of patients with survival rate more than 5 years was significantly lower than those with survival rate less than 5 years（P＜0.01）.ConclusionMMP-2 expression was closely related to the invasion，metastasis and prognosis of gastric cancer.Detection of MMP-2 has important clinical significance in the invasion and metastasis prediction，prognosis evaluation and guiding rational treatment of gastric cancer.