高效液相色谱法测定通淋舒片中槲皮素的含量

郭培果

贵州省贵阳济仁堂药业有限公司，贵州 贵阳 550005

高效液相色谱法测定通淋舒片中槲皮素的含量

郭培果

贵州省贵阳济仁堂药业有限公司，贵州 贵阳 550005

目的：建立测定通淋舒片中槲皮素含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Thermo C18柱，流动相为甲醇－0.4%磷酸溶液（43∶57），流速为1.0mL／min，检测波长360nm，进样量为10μL，柱温为30℃。结果：槲皮素进样量在81.25～650.00μg（r＝0.9999）范围内与峰面积积分值线性关系良好；平均加样回收率为99.20%，RSD为1.05%（n＝6）。结论：该方法快速简便、准确可靠、重复性好、可用于通淋舒片中槲皮素的含量测定。

通淋舒片；槲皮素；高效液相色谱法；含量测定

通淋舒片是由 《国家中成药标准汇编》内科·肾系分册收载的“通淋舒颗粒”［WS－10413（ZD－0413）－2002］［1］改剂型而成，由四季红、车前草等中药组成，具有清热解毒，利尿通淋之功效。用于湿热蕴结所致淋证的排尿不畅，淋漓涩痛；脾肾阳虚所致的腰膝酸痛，肢冷畏寒，失眠健忘，头晕耳鸣，疲乏无力等症。为了更好的控制药品质量，参考相关文献［1～6］，进行了色谱条件优化和方法学考察。方法学研究表明，该方法简便、准确、重复性好，可作为该制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－10ATVP高效液相色谱仪；SPD－10AVP紫外检测器；威玛龙色谱数据工作站（WML－2010）；HT－230A色谱柱恒温箱；UV－1750型紫外可见分光光度计；岛津AUW120D型万分之一电子天平。

1.2 试药 槲皮素对照品 （中国药品生物制品检定所，批号为100081－200907，供含量测定用）；通淋舒片由贵阳济仁堂药业有限公司研制；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 Thermo C18（250mm× 4.6mm，5μm）色谱柱；甲醇－0.4%磷酸溶液（43∶57）为流动相；流速为1.0mL／min；检测波长为360nm；进样量10μL；柱温为30℃。理论板数按槲皮素峰计＞3000；槲皮素其它杂质峰的分离度R＞1.5，拖尾因子（T）为0.99。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品16.25mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得槲皮素对照品贮备液（每1mL含0.3250mg）。精密吸取2mL对照品贮备液，置20mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得槲皮素对照品溶液 （含槲皮素32.50μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，除去包衣，打粉，混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸－水（7∶1∶2）混合液20mL，称定重量，加热回流2.5h，取出，冷却，再称定重量，用甲醇－盐酸－水（7∶1∶2）混合液补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按通淋舒片的制备工艺及制法，制备缺四季红的阴性样品；取约1g，精密称定，置具塞锥形中，按“2.2.2”的制备方法制备缺四季红阴性对照溶液。

2.3 干扰性试验的考察 取对照品溶液、供试品溶液和缺四季红的阴性对照溶液，各10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并进行分析。由图1可知，槲皮素峰与杂质峰完全分离，而缺四季红的阴性对照液在与对照品相同的位置，无相应的色谱峰出现。

2.4 线性关系的考察 精密吸槲皮素对照品贮备液 （浓度为0.3250mg／m L）0.25、0.5、0.75、1、1.5、2m l置10m L容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得含槲皮素为8.125、16.250、24.375、32.500、40.63、48.750、65.000μg／mL的溶液。分别吸取10μL，测定。结果表明，槲皮素在进样量为81.25～650.00μg（r＝0.9999）范围内具有良好的线性关系。以进样量 （X）对峰面积 （Y）进行回归，得回归方程为：Y＝1852.3658X＋3.8827，r＝0.9999。

2.5 精密度试验 精密吸取浓度为32.50μg／mL槲皮素对照品溶液，重复进样测定6次，记录峰面积，槲皮素峰面的RSD为0.02%，表明具有良好的精密度。

2.6 重复性试验 取通淋舒片样品6份，每份约1g，精密称定，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，分别吸取供试

品溶液10μL注入高效液相色谱仪中测定含量，结果槲皮素的平均含量为0.6526mg／g，RSD为0.53%，说明本法重现性良好。

2.7 稳定性试验 取供试品1g，按“2.2.2”的方法制备成供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、2、4、6、8、10h进样测定，记录峰面积，结果峰面积的RSD为0.45%，表明室温下10h内具有良好的稳定性。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品 （槲皮素含量0.6526mg／g）6份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入10mL槲皮素对照品溶液 （浓度为32.50μg／mL），按上述样品制备方法和色谱条件，制备供试液并注入高效液相色谱仪，测定，计算，结果平均回收率为99.20%，RSD＝1.05%。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）

2.9 样品含量测定 取本品10批，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定本品的含量，每批取2个样品平行测试，计算，结果各批次含测结果的RSD均小于2%，见下表。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 波长的优选 参照 《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版 “头花蓼”质量标准 “含量测定”项下的检测波长和国家药品监督管理局 《国家中成药标准汇编》内科·肾系分册收载的 “通淋舒颗粒”标准 “含量测定”项下的检测波长，同时结合本品紫外扫描图 （取槲皮素对照品适量，加甲醇稀释，扫描，结果槲皮素在359.0nm处有最大吸收），确定本品的检测波长为360nm［1、2］。

3.2 提取溶剂的优选 试验中我们曾分别对甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、甲醇－盐酸－水 （7∶1∶2）混合液［1、2］、甲醇－25%盐酸溶液 （4∶1）混合液提取用溶媒进行比较，结果以甲醇－盐酸－水 （7∶1∶2）混合液提取液效果最好，故确定以甲醇－盐酸－水 （7∶1∶2）混合液为溶剂。

3.3 提取方法的优选 参照文献，以甲醇－盐酸－水（7∶1∶2）的混合液为提取溶媒，考察了超声处理和回流提取等不同的提取方法，结果采用回流提取槲皮素含量较高，故将其作为本品的提取方法。同时对不同的回流提取时间1、1.5、2、2.5、3h进行了考察，结果回流提取2.5h效果最佳。

3.4 流动相及流动相比例的优选 本研究曾对甲醇－0.4%磷酸溶液、甲醇－水－甲酸、甲醇－0.2%磷酸溶液等多个流动相系统进行比较。结果表明：流动相以甲醇－0.4%磷酸溶液较好。并考察了甲醇－0.4%磷酸溶液不同比例（41∶59、43∶57、45∶55），结果槲皮素峰峰与其它杂质峰能较好分离，无明显差异，最终确定流动相为甲醇－0.4%磷酸溶液（43∶57）。

［1］国家药品监督管理局.《国家中成药标准汇编》内科·肾系分册 ［S］，2002：58.

［2］贵州省药品监督管理局编. 《贵州省中药材、民族药材质量标准》［M］.贵州科技出版社，2003.147.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.2010年版.北京：化学工业出版社，2010：198，204，849，1079，1080.

［4］陈秋晨，王琳，刘振.HPLC测定四季红药材中槲皮素的含量［J］.解放军药学学报，2008，24（4）：365－367.

［5］李雨生，王祥培，万德光，等.HPLC法测定头花蓼中槲皮素与山奈酚的含量［J］.中药与临床，2011，2（3）：24－26.

［6］苏赤.高效液相色谱法测定乳舒片中槲皮素含量 ［J］.医药导报，2011，30（5）：642－643.

R283.6

A

1007－8517（2013）13－0013－02

2013.04.17）

郭培果 （1978～），男，布依族，执业药师。

郭培果，执业药师，Tel：0851－5400121－8804，E－mail：guozdq＿888＠163.com