响应面法优化红雪茶中类胡萝卜素的提取工艺

杨青松，赵 艳，王 莹，熊 勇，邓芳轶

(1.云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明650500; 2.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650500; 3.云南农业大学基础与信息工程学院，云南昆明650201; 4.云南省食品药品检验所化学室，云南昆明650011)

红雪茶为地衣类梅衣科(Parmeliaceae)金丝属(Lethariella(Mot.)Krog.)2种不同地衣的统称，即金丝刷(L.cladoniioides)和金丝带(L.zahlbruckneri)［1-2］。红雪茶由于其地衣体为橘红色至土红色，开水冲泡后色泽红亮，犹如红葡萄酒色，故在滇西北又称为鹿心雪茶。现代医学研究表明，红雪茶具有清热、抗炎、抗疲劳、抗辐射等作用［3-6］，具有镇静、消炎、止痛的功能［7］。据考证，少数民族，尤其是藏族将其作为茶饮具有悠久的历史［1］，是一种天然、无污染、无毒副作用的野生饮品，具有较高的开发价值。植物源天然色素由于其色调自然、安全性高，同时大多数兼具营养和药理作用，目前已逐渐替代人工合成色素［8-9］。对天然色素的开发和应用成为行业热点，而类胡萝卜素以其特殊生理功能和药理功能一直是研究的热点［10-11］。红雪茶色素是一种天然食用色素，可用于食品，医药等行业中［12］。为充分利用这一资源，本文基于响应面分析法，建立合适的BBD实验模型，对丙酮提取红雪茶类胡萝卜素工艺在料液比、提取时间、提取温度3个因素上进行优化，最终获得其最佳提取工艺，为日后红雪茶深加工等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红雪茶 2011年9月购自云南省香格里拉县山原土特产品经销店;丙酮 分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司;蒸馏水 实验室自行制备。

FA1204B电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司;DFT-100手提式小型植物试样粉碎机 北京科思佳科技有限责任公司;1650F紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;HWS-24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品类胡萝卜素的提取 使用小型植物试样粉碎机粉碎样品，过100目筛，用丙酮浸提，过滤后，滤液浓缩，获得类胡萝卜素提取液。

1.2.2 样品类胡萝卜素含量的测定 浸提液过滤后，以丙酮为参比液，使用紫外可见分光光度计在最大吸收波长445nm，进行比色法测定吸光值。

依照中华人民共和国国家标准《水果、蔬菜汁类胡萝卜素全量的测定GB12291-90》计算提取液类胡萝卜素含量:

其中:A为提取液在最大吸收波长下的吸光值; 20为换算系数。

再根据式(1)以式(2)计算类胡萝卜素的实际含量:

其中:V为提取液样品的体积(m L);F为提取液样品在测定吸光值时的稀释倍数;M为红雪茶样品干粉质量(g)。

1.2.3 单因素实验 选取料液比(g/m L)、提取温度(℃)、提取时间(min)3个影响因素，考察这3个因素对类胡萝卜素提取量的影响。

1.2.4 响应面实验 本实验采用 Design-Expert7.0软件中的中心组合实验(Box-Behnken Design，BBD)原理，根据单因素实验的结果，确定响应面的实验方案。选取料液比、提取温度、提取时间为自变量，以红雪茶类胡萝卜素提取液的吸光值为响应值，进行三因素三水平响应面分析实验，优化其提取工艺条件。根据单因素实验结果，设计了响应面实验因素水平，见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 料液比对红雪茶类胡萝卜素得率的影响 称取红雪茶粉1.00g，分别设定料液比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7(g/m L)，在30℃条件下提取30min，实验结果如图1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface analysis

图1 料液比对类胡萝卜素提取的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction of carotenoids

由图1可知，随着液体比例的增加，类胡萝卜素的提取量先小幅度上升，当料液比到达1∶3时，提取量达到最大。但随液体比例持续增加，类胡萝卜素的提取量逐渐呈现下降趋势。因此选择料液比1∶2、1∶3、1∶4作为红雪茶类胡萝卜素提取的响应面分析料液比3水平。

2.1.2 提取时间对红雪茶类胡萝卜素得率的影响

称取红雪茶粉1.00g，提取时间分别设定为10、20、30、40、50、60m in，在料液比1∶3(g/m L)、温度30℃条件下浸提，结果见图2。

图2 提取时间对类胡萝卜素提取的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction of carotenoids

由图2可知，提取时间10～20m in，类胡萝卜素的提取量变化不明显;当提取时间达到30m in时，提取量明显增加，并达到最大值。随着提取时间延长，类胡萝卜素的提取量逐渐降低，可能是因为随着时间的延长，丙酮挥发越明显。因此，选择20、30、40m in作为类胡萝卜素的响应面分析提取时间3水平。

2.1.3 提取温度对红雪茶类胡萝卜素得率的影响 称取红雪茶粉1.00g，提取温度分别设为25、35、45、55、65、75℃，在料液比1∶3(g/m L)条件下浸提30m in，实验结果如图3所示。

表3 回归模型方差分析Table3 Variance analysis for regression model

图3 提取温度对类胡萝卜素提取的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of carotenoids

由图3可知，随着提取温度的升高，类胡萝卜素的提取量有明显的增加，当温度到达55℃时，提取量最大。提取温度继续增加，类胡萝卜素的提取量有小幅度的降低，这可能是浸提温度过高，导致溶剂挥发损失所致。因此，选择45、55、65℃作为类胡萝卜素提取的响应面分析温度3水平。

2.2 响应面优化提取工艺参数

2.2.1 响应面法优化实验结果 采用Box-Behnken实验设计对红雪茶类胡萝卜素提取条件进行3因素3水平的响应面分析实验，结果见表2。

运用Design expert7.0软件对实验点的响应值进行回归分析，结果见表3。

以红雪茶类胡萝卜素提取液的吸光值为响应值，得到红雪茶类胡萝卜素对自变量X1(料液比)、X2(提取温度)、X3(提取时间)的回归方程:

表3中模型项p值为0.0002，该值小于0.01，说明该模型回归极显著，可用于红雪茶类胡萝卜素的实验设计。回归方程的相关系数R2=0.9664与决定系数为R=0.9233相差不大，表明回归方程的拟合度好，失拟小，可用该回归方程优化红雪茶类胡萝卜素的提取工艺。同时表3中的 p值表明，方程中X1X2、X2X3、X、X对类胡萝卜素提取液的吸光值有极显著影响。失拟项p值为0.2776，说明无显著性影响，说明数据中没有异常点，模型适当，不需要引入更高次数的项。

表2 响应面实验设计及结果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.2.2 响应面直观分析 根据回归方程，获得料液比、提取温度和提取时间两两相互作用对类胡萝卜素提取量的影响，结果见图4。

图4 各两因素交互作用的响应曲面图Fig.4 Response surface and contour plots of cross-interaction between each two factors

图4a中响应面的坡度很陡，可以得出料液比和提取温度的交互影响对类胡萝卜素的提取有显著影响;温度轴的等高线变化密集，料液比轴的等高线变化稀疏，所以料液比对响应值峰值的影响较提取温度大。图4b中响应面的坡度较陡，可以得出提取时间和料液比的交互影响对类胡萝卜素提取的影响不够显著，通过等高线的疏密可以判断在交互影响中料液比对响应值的影响大于提取时间。图4c中响应面的坡度较陡，可以得出提取温度和提取时间的交互影响对类胡萝卜素提取的影响不够显著，通过等高线的疏密可以判断在交互影响中提取温度对响应值的影响大于提取时间。故对红雪茶类胡萝卜素提取量的影响大小顺序为料液比(X1)＞提取温度(X2)＞提取时间(X3)，其中料液比的影响极显著。

通过Design-Expert 7.0软件分析，可以获得红雪茶类胡萝卜素的最佳条件是在料液比为1∶3.07，温度51.45℃，提取时间20.00min时，红雪茶类胡萝卜素提取量的预测吸光值为0.3794，理论类胡萝卜素提取量为23.295μg/g。采用最优条件进行实验验证，实际测得类胡萝卜素提取条件为料液比1∶3，提取温度52℃，提取时间20m in，红雪茶类胡萝卜素提取量的吸光值平均为 0.3682，类胡萝卜素提取量达到22.092μg/g，实际值与理论值的相对误差较小，说明该实验通过响应面法优化后得到的红雪茶类胡萝卜素提取条件准确、可靠。

3 结论

类胡萝卜素在自然界中广泛存在，具有特殊的生理功能和药理功能，对人类的健康非常重要。但由于人类自身无法合成类胡萝卜素，所以类胡萝卜素的制备显得很重要。目前制备天然的类胡萝卜素常用的方法有:有机溶剂提取法、酶反应法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法等［13］。其中后4种提取法都极大的提高了类胡萝卜素提取率［14-17］，如张卫强等［14］应用微波辐射萃取番茄红素，在最佳的工艺条件下，色素提取率为97.56%。熊犍等［15］采用超声辐射提取玉米类胡萝卜素，得到的类胡萝卜素的浓度是无超声辐射时的16.25倍。但酶反应法和超临界流体萃取法仪器装置复杂，不利于推广应用。而微波辅助提取法和超声波辅助提取法则是以有机溶剂提取法为基础的。因此对常规有机溶剂提取法工艺优化是提高类胡萝卜素提取率的基础。

本研究通过单因素实验和响应面实验，基于常规有机溶剂提取法对红雪茶类胡萝卜素提取工艺进行优化，优化后得到的红雪茶类胡萝卜素提取最佳工艺条件为:料液比1∶3(g/m L)、提取温度52℃、提取时间20min，在该条件下类胡萝卜素提取液的吸光值为0.3682，实际获取红雪茶类胡萝卜素22.092μg/g，与预测值接近。该实验获得的优化提取条件，能有效提高红雪茶类胡萝卜素的提取量，为今后的开发利用提供一定的理论参考。

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