连翘叶提取物抑菌作用以及稳定性研究

原江锋，王大红，何灵美，闫国琦，张清安

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003; 2.山西芳灵贸易有限责任公司，山西太原030045; 3.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)

食品的腐败变质主要由微生物引起［1］，食品防腐剂在延长食品贮藏期、保证食品品质的过程中具有非常重要的作用。传统食品防腐剂是以化学合成品多见，由于化学合成的防腐剂涉及到安全性问题，许多国家已逐步禁止或限制使用。因此研究天然食品防腐剂已经成为食品科学领域研究的热点。伏牛山区中药资源占河南省总数的76.9%，药用植物的品种数量和储存量均位于全国前列，是全国药用植物主要产区之一，其中连翘年产量占全国总产量的40%。伏牛山区连翘果实中连翘苷和连翘酯苷的含量远远高于其他地区［2］;近年来的研究发现连翘叶中有效成分如连翘苷、连翘脂苷、芦丁等的含量高于果实［3-4］。由于连翘叶没有进入国家药典，因此连翘叶资源尚未得到足够的开发利用，造成大量的连翘叶片被遗弃，将连翘叶提取物作为天然防腐剂应用在食品工业中，既可以提升连翘叶的价值，又可以为食品工业发掘新原料。本研究在伏牛山地区FSLE抗菌性能的基础上，进一步研究热处理、pH、紫外线、氧化剂和金属离子对连翘叶提取物(Forsythia Suspensa leaves extract，FSLE)抑菌稳定性的影响，为伏牛山地区FSLE开发成安全可靠的食品天然防腐剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

连翘叶采自河南省伏牛山地区，自然晾干，对其进行研磨粉碎备用。银杏叶提取物是河北天成药业股份有限公司市售产品(总黄酮醇苷9.6mg/g，萜类内酯2.4mg/g)。指示菌:细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli);真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus);以上菌种均由河南科技大学食品与生物工程学院实验教学中心提供。指示菌培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基［5］。

RE2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;HK-02A手提式粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司; LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;BS210S分析天平 北京赛利斯天平有限公司;DL-5-B离心机 上海安亭科学仪器厂;202电热恒温干燥箱 北京市永光明医疗仪器厂;HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市江南仪器厂; YQDL201，YQDL204微量移液器 北京东林昌盛生物科技有限公司;HPS-250生化培养箱 哈尔滨市东明医疗仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 FSLE的制备 连翘叶以1∶10(w∶w)比例加蒸馏水，于80℃提取30m in后过滤，滤渣再重复煎煮两次，合并3次滤液，浓缩干燥至浸膏，临用前用不同条件处理后配成5%溶液浓度。

1.2.2 菌种活化及菌悬液的制备［6］将所有供测试的细菌和真菌分别接种于牛肉膏蛋白胨和PDA固体斜面培养基上，细菌置37℃恒温培养箱培养24h，霉菌置28℃恒温培养箱培养48h，连续传代2次。将上述活化好的各种菌分别挑取一环制成初试菌悬液，取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为106～107CFU/m L的菌悬液备用。

1.2.3 FSLE抑菌性实验［7］将吸水性强的滤纸片用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片。将滤纸高压灭菌后用无菌镊子将滤纸片浸入无菌水、质量浓度为5%无菌过滤的FSLE和银杏叶提取物的溶液中30m in，烘干备用。分别在牛肉膏蛋白胨培养基或PDA表面加入0.2m L供试菌的菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，15min后用无菌镊子夹取滤纸片贴于涂菌平板上。细菌于37℃恒温培养24h，霉菌于28℃恒温培养48h，观察菌落生长情况，采用十字交叉法测定抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以上操作均在超净工作台上完成。

1.2.4 温度对FSLE稳定性的影响［8］将FSLE分别在80、100、121℃处理30min，用蒸馏水配制成质量浓度为5%的溶液，无菌过滤。以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，按1.2.3方法测定其抑菌活性。

1.2.5 pH对 FSLE抗菌效果的影响［9］用1mol/L HCl和NaOH溶液把质量浓度为5%FSLE调至pH4、5、6、7、8、9，无菌过滤，平衡24h后以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，置37℃培养箱中培养24h后测定抑菌圈直径大小，实验重复3次。

1.2.6 紫外照射对FSLE抑菌活性的影响［10］称取若干份样品，分别置于20W的紫外等下照射10、30、60、90、120m in，用蒸馏水配成5%的样液，无菌过滤。同样以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，每项抑菌实验均平行重复3次。

1.2.7 氧化剂对FSLE抑菌活性的影响 将FSLE配制成含3%H2O2的5%的样液，无菌过滤后测定对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率。以未处理的样品作为对照，实验均重复3次。

1.2.8 金属离子对FSLE稳定性的研究［9］用1mol/L的不同金属离子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+)溶液浸泡FSLE，将处理过的FSLE配制成5%的样液，12h后测定其抑菌活性，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 FSLE的抑菌活性测定

由表1可知，FSLE对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，其次是对大肠杆菌的抑制作用，对枯草芽孢杆菌的抑制作用较弱;而对根霉和黑曲霉无抑制作用。对不同的供试菌种的抑制效果在淡竹叶提取物中也有相同结果报道［11］。因此选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为对FSLE的稳定性实验的菌种。

表1 FSLE和银杏叶提取物对常见菌的抑制效果Table1 Inhibitory effect of Forsythia Suspensa leaves extract and Ginkgo leaves extract on common bacteria strains

这一特点提示:FSLE添加于食品中对细菌类具有较强的抑制活性，对真菌类的抑制还需要其它的防腐剂配合使用。由表1还可以看出，连翘叶提取物和阳性对照银杏叶提取物的抑菌活性相比，FSLE具有较强的活性。

2.2 温度对FSLE抑菌活性的影响

图1 温度对FSLE抑菌的影响Fig.1 The impact of temperature on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

由图1可知，随温度上升，其抑菌效果呈下降趋势，说明温度对FSLE的抑菌活性有一定的影响。但总体来说，FSLE在80～121°C范围内处理30min仍具有较强的抑菌效力，表明FSLE比较稳定，不易产生热变性，具备在食品中的使用要求。这与陈佳佳［12］得出桑叶提取物具备良好抗热性的结论一致。这一热稳定性的特点提示:FSLE即使添加于需进行加热处理的食品中，也可稳定保持其抗菌防腐性能，可作为热加工食品中的防腐剂。

2.3 pH对FSLE抑菌作用的影响

pH对FSLE抑菌作用的影响见图2，在pH6时，FSLE抑菌效果达到最好，当pH≤5或pH≥7时，随着FSLE处理的pH逐渐降低或升高，FSLE的抑菌效果均会逐渐降低。可能原因是，pH升高或降低，改变了提取物有效抑菌成分结构;而在中性和弱酸的环境下FSLE的结构较稳定，具有较强的抑菌活性。这一特点提示，FSLE作为防腐剂添加在食品中，在中性和弱酸性环境中抑菌活性较强。

图2 FSLE在不同pH下的抑菌活性Fig.2 The antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract at different pH

2.4 紫外线对FSLE抑菌作用的影响

紫外照射实验结果由图3可知，FSLE经不同时间的紫外照射后，在少于30m in对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制能力几乎没有影响，但是在30～120min范围，FSLE的抑菌能力有所影响;而紫外线照射对FSLE对大肠杆菌的抑菌能力影响一直较大。由此看出对于不同菌种，FSLE的抑菌活性具有不同的紫外光稳定性，推测原因为FSLE对不同菌种的抑菌机制存在差异。这一特点提示，环境中的紫外线的存在和长时间照射可能会影响到FSLE抑菌性能的发挥。

图3 紫外照射对FSLE抑菌效果的影响Fig.3 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

2.5 氧化剂对FSLE稳定性的影响

由图4可以看出，氧化剂H2O2对FSLE的稳定性影响较大，可能原因是FSLE有效抑菌成分大多含不饱和双键和其他可氧化基团，使得氧对FSLE的有效抑菌成分造成破坏，从而导致其有效抑菌成分浓度的降低，所以FSLE应密封保藏。这一特点提示: FSLE作为防腐剂，应避免长期与空气接触造成其抑菌效果的降低的问题。

图4 氧化剂对连翘叶抑菌的影响Fig.4 Effect of oxidants on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

2.6 金属离子稳定性的研究

由图5可以看出，经Na+、K+处理后，FSLE仍具有较强抑菌性能，但与未处理组相比，抑菌活性略有下降。而经钙、铜、铁离子处理后其抑菌活性稍提高，其原因可能是重金属及过渡金属离子本身对菌体的生长存在抑制作用。这一特点提示:FSLE作为防腐剂可以应用在含有钠、钾、钙、铜和铁等金属离子较丰富的食品中。

图5 金属离子对提取物抑菌活性的影响Fig.5 Effect ofmetal ions on antimicrobial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

3 结论

3.1 本实验中，FSLE对所试三种细菌具有比较好的抑制作用，而对所试真菌的抑制效果不明显。植物中的提取物中如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾类、酚类、独特的氨基酸和多糖等都具有杀虫和抗菌活性，本课题组下一步将进行FSLE主要抑菌活性物质的分离纯化与结构分析研究，从而明确抑菌的物质基础。

3.2 FSLE的抑菌活性具有良好的热稳定性;在中性和弱酸性环境中FSLE抑菌活性较强;在大于30m in紫外线照射对FSLE抑制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性有一定影响;对大肠杆菌的影响较大;应尽量减少FSLE在空气中的暴露时间;不同的金属离子对FSLE抑菌性能影响不同，这些都是在实际应用中需要切实考虑的问题。

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