鼠李糖乳酸杆菌对高脂饮食和链脲霉素诱发的Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用

陈 佩，党 辉，2，张秋香，刘小鸣，赵建新，陈永泉，张 灏，*，陈 卫

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；3.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

糖尿病已逐步成为威胁人类健康的头号杀手。根据1999年世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（IDF）公布的定义，Ⅱ型糖尿病患者约占90%以上，因胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足，患者常年伴有高血糖[1]。研究表明，多种前炎标志物及促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白介素-6等参与了糖尿病及其血管并发症的形成，与糖尿病的发展明显相关[2]。白细胞介素-10是一种抗炎因子，在调节先天免疫系统起着关键的作用，可有效地抑制促炎症因子如肿瘤坏死因子-α的生成[3]。另外，也有证据表明氧化应激在糖尿病及其并发症的发生和发展中起着重要的作用[4-5]。

目前口服降糖药主要有五类，包括α-糖苷酶抑制剂、磺脲类、氯茴苯酸类、双胍类、噻唑烷酮类药物[6]，但是这些药物的使用会产生一定的副作用。近年来，有研究证实乳酸菌具有一定的降糖作用。Yun等[7]研究表明加氏乳酸杆菌BNR17与对照组相比可显著降低db/db小鼠的血糖水平。有研究证实乳酸菌可以显著降低高果糖诱导的糖尿病大鼠的氧化应激和提高胰腺谷胱甘肽酶的合成，降低氧化应激引起的胰腺炎[8-9]。以上结果表明乳酸菌可阻止或延缓各种模型糖尿病的发生。

本文所用鼠李糖乳酸杆菌是由本实验室分离于健康人体粪便，并且对其基本的益生特性和体外对大鼠肠道α-糖苷酶的抑制作用做了研究。本研究通过高脂饮食和注射链脲霉素（STZ）诱导建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，灌胃鼠李糖乳酸杆菌活菌制剂后观察其血糖、免疫调节相关的炎症因子以及氧化应激反应相关的各种酶等，研究鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病是否具有降糖作用，并对其降糖机理进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠李糖乳酸杆菌 江南大学食品生物与技术中心菌株保藏库；MRS（De Mann，Rogosa，and Sharpe）培养基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.1g，一水硫酸锰0.05g，吐温-801m L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L，调节pH为6.2～6.4；C57BL/6J小鼠和饲料 上海斯莱克实验动物有限公司；STZ 美国Sigma；吡格列酮 江苏德源药业有限公司；糖基化血红蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子-α、白介素-6及白介素-10检测进口分装ELISA试剂盒 英国Abcam；内毒素检测进口分装ELISA试剂盒 美国Sigma；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽酶（GSH）、丙二醛（MDA）检测试剂盒 武汉博士得生物工程有限公司。

5415R型冷冻离心机 德国Eppendorf；CX41-12C02型倒置显微镜日本Olympus；血糖仪 台湾博仕珑。

1.2 实验方法

1.2.1 冻干菌粉的制备 将冻存于-80℃的鼠李糖乳酸杆菌接入MRS液体培养基中，37℃培养18h，连续活化三代后，在4℃下6000r/m in离心10m in，弃上清液，将菌体用灭菌的生理盐水洗涤三次后，用12%的脱脂乳溶液作为保护剂制成浓缩冻干粉存于-20℃[7]。灌胃前用生理盐水将冻干粉重悬，调整菌液浓度为4×109CFU/m L，在37℃水浴中复苏30m in后备用。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的建立及分组 28只3周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组（每组7只）：正常组（NG）、模型组（MG）、吡格列酮组（PG）和鼠李糖乳酸杆菌组（LG）。基础饲料适应性喂养一周后，除NG外其余3组喂食高脂饲料。LG小鼠每天灌胃250μL浓度为4×109CFU/m L的菌液直至13周实验结束。2周后（第3周），MG、PG和LG腹腔注射STZ 100mg/kg。将一定量STZ溶于50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中（pH 4.5），现配现用，冰浴保存，NG注射0.9%的生理盐水[10]。造模1周后（第4周），造模成功的糖尿病小鼠其空腹血糖高于7.0mmol/L，餐后2h血糖高于11.0mmol/L[11]。PG开始灌胃吡格列酮10mg/kg直至13周实验结束。体重，空腹和餐后2h血糖每周测量记录一次。

1.2.3 口服葡萄糖耐量检测 口服葡萄糖耐量检测（OGTT）在造模成功后1周（第4周）和实验结束前（第13周）时进行。小鼠禁食不禁水12h，检测血糖含量（0m in），随后小鼠灌胃葡萄糖溶液2g/kg后分别在15、30、60、90、120m in时检测血糖含量。根据血糖值使用Orgin7.5绘制血糖变化曲线，并计算出糖耐量曲线下面积（Under Cerve，AUC）。

1.2.4 小鼠血清及组织的处理 实验结束时（第13周），小鼠禁食不禁水12h后，麻醉后摘取眼球取血，样品在4℃下4000×g离心10min后小心收集上层透明液体为血清，冻存于-80℃备用。

小鼠眼球取血后，脱颈椎处死，迅速取出肝脏和胰腺于冰冷的生理盐水中漂洗拭干，肝脏称重后剪碎倒入玻璃匀浆管中，加入9倍组织块重量的冷生理盐水充分研磨，使其组织匀浆化，将制备好的匀浆液3000×g离心15m in，吸取上清为肝匀浆液，冻存于-80℃备用。胰腺用4%的甲醛溶液固定。

1.2.5 血清中糖尿病相关指标的检测 采用酶标仪检测血清中糖基化血红蛋白、胰岛素、内毒素、肿瘤坏死因子-α、白介素-6和白介素-10的含量，方法参照ELISA试剂盒说明书。

1.2.6 肝匀浆液中抗氧化指标的检测 肝匀浆中的谷胱氨肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱氨肽（GSH）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的检测方法参照武汉博士得生物工程有限公司试剂盒说明书。

1.2.7 组织切片病理观察 取4%甲醛固定48h的胰腺组织，经石蜡包埋后，切片，并用苏木精和伊红染料进行染色（HE染色），在显微镜下观察拍照。

1.3 统计分析

数据统计采用SPSS 16.0进行one-way ANOVA，Duncan’s和Tukey多重检验（p＜0.05），数值以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 小鼠体重变化

实验期间每周监测小鼠的体重变化（图1）。NG小鼠体重一直呈上升趋势，而MG小鼠体重11周后开始明显下降，且在造模后（第3周）比其他3组小鼠的体重都要低，说明糖尿病小鼠的体重增加缓慢。PG小鼠的体重从第7周开始渐渐高于MG，并接近NG，由此可看出吡格列酮可以改善糖尿病小鼠的体重。LG小鼠体重在3～5周显著高于MG（p＜0.05），第8周后开始接近于NG，虽其可以改善糖尿病小鼠体重下降趋势，但与MG比较没有显著性差异，这与Tabuchi等[11]研究结果一致，可能是喂食乳酸菌的时间还不够长。最后一周时，喂食乳酸杆菌的小鼠体重下降较厉害，其与模型组小鼠的体重变化一致，推测可能由于此时小鼠的糖尿病症状加重，达到一个阶段性的峰值，故体重急剧下降。

图1 实验期间的小鼠体重变化Fig.1 Chang in body weight ofmice during the test

2.2 小鼠空腹及餐后血糖变化

由图2中可看出，腹腔注射STZ一周后（第4周），MG和PG小鼠的空腹血糖远远高于参考值7.0mmol/L，餐后2h血糖高于11.0mmol/L，说明糖尿病小鼠模型建立成功。LG小鼠的空腹血糖从第4周至实验结束时都显著（p＜0.05）低于MG小鼠的空腹血糖，并且鼠李糖乳酸杆菌可显著（p＜0.05）抑制LG糖尿病小鼠餐后2h血糖升高。PG小鼠从第5周开始至实验结束，其空腹血糖和餐后血糖都显著低于MG小鼠（p＜0.05）。加氏乳酸杆菌可以显著（p＜0.05）降低Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖和餐后血糖水平[7]，这与本文研究结果一致。

图2 实验期间小鼠血糖水平变化Fig.2 Chang in blood glucose levels ofmice during the test

2.3 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠的OGTT及AUC的影响

第4周时，在灌胃葡萄糖后，各组小鼠的血糖均呈急剧上升，到15m in达到顶峰，之后逐渐下降（图3A）。比较不同组小鼠血糖的下降趋势发现，NG变化非常平缓，在2h后恢复正常。MG在2h后依然保持在较高水平（14.2mmol/L），说明葡萄糖耐受能力显著降低（p＜0.05），符合Ⅱ型糖尿病糖耐量降低的特征。LG小鼠2h后血糖水平下降到11.3mmol/L，略高于正常值。

图3 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠的OGTT及AUC的影响Fig.3 Effectof Lactobacillus rhamnosus in type 2 diabeticmice as revealed by oral glucose tolerance tests and AUC

由图3B中可看出，MG与PG的AUC面积显著高于NG（p＜0.05），而LG的AUC面积显著低于MG（p＜0.05）。说明鼠李糖乳酸杆菌对小鼠的糖耐量具有显著改善作用。喂食鼠李糖乳酸杆菌12周后，与MG相比，其AUC面积显著低于MG（p＜0.05），并与NG和PG无显著性差异（图3C和图3D）。此与Yadav等[8]研究表明的嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌可以改善高糖引起的糖尿病小鼠葡萄糖不耐受结果一致。

2.4 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中糖基化血红蛋白、胰岛素及内毒素的影响

糖基化血红蛋白反映葡萄糖分子连接到红血细胞中的血红蛋白的数量，所以它是用于监视长期的血糖平衡的一个重要因素[11]。内毒素已被证明是高脂饮食引发Ⅱ型糖尿病的一个主要原因[12]。从表1可看出，喂食鼠李糖乳酸杆菌12周后，小鼠血清中糖基化血红蛋白和内毒素的水平较MG分别显著降低了18%和21%。Cani等[13]研究表明双歧杆菌的增加可有效降低糖尿病小鼠体能内毒素水平，因此减轻糖尿病症状。实验结束时，糖尿病小鼠血清中胰岛素的水平恢复正常。

2.5 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中炎症因子的影响

高脂饮食可导致促炎因子如肿瘤坏死因子-α和白介素-6等的升高[13]，促炎因子被证实可引起胰岛素抵抗[14]。白介素-10是一种抗炎细胞因子，抑制抗原呈递和炎症细胞因子的产生[15]。见表2，与MG相比，喂食鼠李糖乳酸杆菌12周后可显著降低小鼠血清中肿瘤坏死因子-α和白介素-6的水平（32%和30%，p＜0.05），并增加白介素-10的含量（17%，（p＜0.05））。Calcinaro等[16]研究表明喂食VSL#3可提高糖尿病小鼠的白介素-10水平从而预防糖尿病的发生，其结果与本研究一致。

2.6 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中抗氧化指标的影响

MDA为脂质过氧化的产物，其含量可反映机体内脂质过氧化程度，间接反映出肝细胞受自由基攻击的严重程度。GSH是存在于肝脏中主要的水溶性抗脂质过氧化的物质，它可以调节细胞内的氧化还原反应，因而GSH含量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素[17]。而GSH-Px以GSH为底物和SOD共同清除机体ROS，减轻和阻止ROS的过氧化作用。表3表明，LG的GSH-Px和GSH的水平与MG相比分别升高了34%和15%，但是ROS的水平无显著变化。与MG相比，LG和PG的SOD水平分别显著提高了49%和25%，MDA的含量则分别显著下降了27%和18%。Yadav等[8]研究发现嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌可提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，并增加肝脏和胰腺的GSH的含量，从而延缓糖尿病的进程。

2.7 小鼠胰腺HE染色

表1 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中糖基化血红蛋白、内毒素及胰岛素的影响Table1 Effect of Lactobacillus rhamnosus on HbA1c，insulin and endotoxin in type 2 dibeticmice

表2 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中炎症因子的影响Table2 Effectof Lactobacillus rhamnosus on serum inflammatory factors in type 2 dibeticmice

表3 鼠李糖乳酸杆菌对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中抗氧化指标的影响Table3 Effectof Lactobacillus rhamnosus on antioxidant indices in type 2 dibeticmice

光镜下观察，NG小鼠胰岛与外分泌腺之间边界清楚，胰岛多为圆形或椭圆形的细胞团，胰岛内细胞排列整齐，大小一致分散于胰腺腺泡之间，胞浆呈浅红色着染，细胞核呈蓝色着染（图4a）。MG小鼠胰岛萎缩，形态极不规则，细胞数量减少，大小不一，部分细胞核缺失，只留伊红浅染的细胞质（图4b）。PG和LG小鼠胰岛数及岛内细胞数较MG小鼠多，形态较为规则，细胞分布均匀，只有少部分的细胞核固缩（图4c～d）。已有研究报道嗜酸乳杆菌对STZ所致的Ⅱ型糖尿病小鼠的胰岛结构具有保护作用[18]，这与本文的研究结果一致。

图4 小鼠胰腺切片HE染色结果（200×）Fig.4 HE staining of pancreatic tissue ofmice（200×）

3 结论

本研究表明，鼠李糖乳酸杆菌可有效预防高脂与STZ诱导的Ⅱ型糖尿病的发生，从而降低血糖水平和改善糖尿病相关症状。推测这可能是由于鼠李糖乳酸杆菌保护胰岛细胞免受损伤，并增强了机体的免疫调节性和抗氧化能力，未来可进一步研究其是否对机体免疫调节相关的基因表达量和肠道菌群构成有影响。

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