响应面优化混菌固态发酵豆粕制备多肽饲料的发酵条件

2013-02-20王哲奇齐景伟安晓萍陈大勇仝宝生

饲料工业 2013年9期

■ 王哲奇齐景伟安晓萍陈大勇仝宝生

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古斯隆生物技术有限责任公司，内蒙古呼和浩特 011517）

大豆多肽是以大豆蛋白质为原料，经酸、碱或酶的水解作用后而得到的由不同氨基酸组成的多肽链的通称[1]。通过酶降解大豆蛋白，能使大豆蛋白中的抗原成分大大减少，用酶免疫测定法研究发现，与大豆蛋白质相比，大豆肽的抗原性仅为大豆蛋白质的1/100～1/1 000[2]。已有实验发现大部分蛋白质在多肽形态时就能被吸收，且动物体内大部分蛋白质也是以多肽形式直接吸收的。因此，大豆多肽在肠道的吸收率最好，且其消化吸收性比蛋白质更佳[3]。采用固态发酵制备大豆多肽饲料，具有培养基简单、投资少、能耗低、技术较简单、产物的产率较高、含水量低、发酵后产品处理方便等多个优点，并且固态发酵法可以实现更大规模生产，豆粕饲料产量更大，能有效运用在豆粕饲料加工业中[4]。

李善仁等[5]采用响应面分析法对枯草芽孢杆菌和米曲霉混合发酵豆粕产大豆肽的发酵培养基进行优化，确定最佳培养基条件为料水比为1∶1.149，MgSO4浓度为0.048%，糖蜜浓度为0.294%，在此条件下，优化后的大豆肽含量为21.74%。吴宝昌[6]以肽转化率和蛋白酶酶活为指标确定最佳发酵工艺条件，确定枯草芽孢杆菌1389与米曲霉3.042混合发酵制备豆粕饲料的最佳发酵条件：接种时间差6 h，发酵温度30℃，培养基含水量64%，菌种混合比例1∶1，发酵时间72 h。在此条件下测得发酵豆粕的蛋白酶酶活值在980 U/g左右，大豆肽转化率在50%左右。

本试验在优化好的培养基的基础上，进一步对发酵条件进行优化。发酵底物豆粕中添加麸皮7.5%、腐殖酸钠2%、糖蜜0.2%、磷酸氢二钾1%、硫酸镁0.2%。分别采用Plackett-Burman方法分析发酵时间、加水量、接种量、发酵温度、初始pH值、装料量6种因素对产生多肽含量的影响，确定装料量、发酵时间、发酵温度为影响多肽的重要因素。然后采用响应面法对筛选出的3个对多肽的产量有显著影响的因素再进一步优化。

1 材料与方法

1.1 原料

豆粕：市购，麸皮：市购，腐植酸钠：从褐煤中提取，纯度为42%，由内蒙古永业集团有限公司提供。

1.2 菌种

枯草芽孢杆菌CGMCC1.0895、米曲霉CGMCC 2.0951，购买于中国微生物菌种保藏中心。

1.3 培养基

枯草芽孢杆菌斜面培养基：牛肉膏5 g/l、氯化钠5 g/l、蛋白胨10 g/l、pH值7.0，琼脂20 g/l。

米曲霉斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基。

枯草芽孢杆菌液体种子培养基：牛肉膏5 g/l、氯化钠5 g/l、蛋白胨10 g/l，pH值7.0。

米曲霉液体种子培养基：麦芽汁培养基。

1.4 种子液的制备

枯草芽孢杆菌经斜面活化后刮取一环接入其液体培养基中，35℃，120 r/min培养24 h；米曲霉接种到斜面培养基，32℃培养72～96 h，用无菌生理盐水洗去斜面培养基上的孢子，调整孢子数达到108，最后按枯草芽孢杆菌菌液与米曲霉孢子悬液2∶1的比例混合作为发酵用种子液。接种量按2.5%接入灭菌的发酵培养基中。

1.5 发酵底物

发酵底物：糖蜜0.2%、腐殖酸钠2%、磷酸氢二钾0.7%、麸皮7.5%，250 ml三角瓶中豆粕装量按需要分为10、20、30 g。

1.6 PB实验设计

对发酵时间、加水量、接种量、发酵温度、初始pH值、装料量6个因素进行全面考察，选用N=12的Plackett-Burman设计，每个因素分别取（1，-1）高低两水平，各因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平

1.7 响应面试验

根据Box-Behnken中心组合设计原理，对Plackett-Burman设计中筛选出装料量、发酵时间、发酵温度三个重要影响因素设计三因素三水平共15个实验点的响应面分析实验，其中12个是析因点，3个零点重复[7]。

表2 Box-Behnken响应面试验设计各因素水平

1.8 多肽含量的测定

烘干的豆粕研磨过60目筛，准确称取2.000 g，加蒸馏水溶解并定容至100 ml，取10 ml并加入等体积15%三氯乙酸溶液，静止5 min后，4 000 r/min离心，取上清液。凯氏定氮法测定发酵产物中酸溶性蛋白的含量[8]。茚三酮显色法测定发酵产物中游离氨基酸的含量[9]。多肽含量为酸溶性蛋白与游离氨基酸之差[8]。

1.9 数据处理

本试验采用Minitab 16分析软件设计试验及对试验结果进行数据统计分析。

2 实验结果

2.1 Plackett-Burman设计结果

对6个因素进行全面考察，选用N=12的Plackett-Burman设计，利用Minitab 16软件对多肽含量进行回归分析，结果见表3和表4。由回归分析可知，发酵时间对多肽含量的影响极显著(P=0.006)，其次是发酵温度对多肽含量影响显著(P=0.072)，装料量对多肽含量影响也较显著(P=0.088)，而接种量、加水量，初始pH值对多肽含量的影响均不显著（P＞0.1）。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果

表4 Plackett-Burman试验方差分析结果

2.2 响应面结果

选用装料量、发酵时间、发酵温度为自变量，发酵产物中的多肽含量为响应值，试验结果见表5。

表5 响应面分析试验设计及结果

回归分析试验数据通过统计分析软件Minitab 16进行二次回归分析，建立二次响应面回归模型为：

其中复相关系数的平方R2=88.12%，说明这种试验方法是比较可靠的。对回归方程进行方差分析和显著性检验，结果见表6。

根据上述拟合回归方程作响应面分析图，结果见图1、图2、图3。

表6 二次回归方差分析

图1 装料量-发酵时间响应面分析(发酵温度30℃)

图2 装料量-发酵温度响应面分析(发酵时间84 h)

图3 发酵时间-发酵温度响应面分析(装料量20 g)

图1显示的是发酵温度30℃时，装料量(X1)与发酵时间(X2)对大豆多肽含量的交互影响效应，在本实验水平范围内，随装料量(X1)减少，大豆多肽含量是增加的；随发酵时间（X2）的增长，大豆多肽含量也是增加的。图2显示的是发酵时间84 h时，装料量(X1)与发酵温度(X3)对大豆多肽含量的交互影响效应，在本试验水平范围内，随装料量(X1)减少，大豆多肽含量是增加的；随发酵温度（X3）的升高，大豆多肽也含量是增加的。图3显示的是装料量20 g时，发酵时间(X2)与发酵温度(X3)对大豆多肽含量的交互影响效应，在本试验水平范围内，随发酵时间（X2）的增长，大豆多肽含量增加；随发酵温度(X3)的升高，大豆多肽含量增加。

最终由Minitab 16分析软件中响应优化器得到：X1=-1；X2=1；X3=1时，即装料量10 g；发酵时间96 h；发酵温度34℃。此时大豆肽含量的理论值可达21.97%。

3 讨论

本文通过二水平设计的Plackett-Burman实验分析了6种因素对米曲霉和枯草芽孢杆菌混合固态发酵豆粕产多肽量的影响，选择出影响显著的装料量、发酵时间、发酵温度这三个影响因素根据Box-Behnken中心组合设计原理建立了主要因素影响多肽产量的二次响应面回归模型。并利用统计学的方法对该模型进行显著性检验，优化各因素水平，探讨了它们之间的交互作用。在最佳发酵条件：装料量10 g；发酵时间96 h；发酵温度34℃。多肽含量的理论值可达21.97%，实际试验中验证得到多肽含量为21.32%，与理论值相差不大。由此可见采用响应面分析法对米曲霉和枯草芽孢杆菌混合固态发酵豆粕发酵条件进行优化是比较有效的。该研究结果为枯草芽孢杆菌和米曲霉固体发酵工艺开发提供了一定的理论基础和参考价值，但由于优化所得的最优点均在边缘水平，所以还需扩大范围再进一步优化。