定性测定羊饲料中黄曲霉毒素总量残留的高灵敏度检测卡的研制

■ 武玉香 沈志强， 唐士云

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

黄曲霉毒素属于结构相似的黄曲霉毒素类化合物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生致肝癌甚至死亡。GB17480—2008指出了饲料中黄曲霉毒素B1的测定——酶联免疫法。NY/T 2071—2011指出了饲料中黄曲霉毒素B1的液相色谱-质谱法检测，这两种方法均需要在实验室条件下操作，后者对样本的前处理要求严格，步骤繁琐，耗时长，需要的检测费用高。本研究的定性测定羊饲料中黄曲霉毒素总量残留的高灵敏度检测卡，可快速准确地应用于羊饲料中黄曲霉毒素总量残留的定性检测，为羊场快速准确地测定羊饲料中黄曲霉毒素总量残留提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AE99硝酸纤维素膜（Whatman公司生产）；SB06玻璃纤维膜、BL-1吸水纸、PVC底板（上海金标生物科技公司生产）；黄曲霉毒素总量全抗原(山东绿都生物科技有限公司生产)；黄曲霉毒素总量单克隆抗体（山东绿都生物科技有限公司生产）；羊抗鼠抗体（美国Jackson公司生产）；氯金酸，分析纯（国药集团生产）。

1.2 仪器与设备

MULTISKAN MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；QL-866振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JE1002型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）。UV1100紫外可见分光光度计(北京普析通用)；85-2恒温磁力加热搅拌器(上海志威电器有限公司)；CT14RD高速冷冻离心机(德国BECKMAN公司)；HGS201 切条机、ZX1000 bio-dot划膜平台(美国bio-dot公司)。

1.3 方法

1.3.1 胶体金的制备及鉴定

一般认为粒径为20 nm的胶体金是最适合单克隆抗体的快速测试[1-3]。量取99 ml的超纯水装入250 ml的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸溶液1 ml，100 r/min速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6 ml柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.3.2 抗体的标记及金标垫的制备

1.3.2.1 抗体标记蛋白浓度的确定

取5支试管，每个管中加入1 ml胶体金溶液，用K2CO3调节胶体金溶液pH值至9.0，加入10 μl稀释不同浓度（分别为0、10、20、30、40 μg/ml）的抗体蛋白，振摇30 min，每管加入10%NaCl溶液各100 μl，最后观察颜色刚好稳定趋于不变的红色试管中蛋白添加量为最少蛋白稳定量，在这个基础上加20%为最适蛋白标记量[7-10]。

1.3.2.2 金标垫的制备

按照1.3.2.1节找出的合适蛋白浓度标记抗体，12 000 r/min离心30 min，小心去除上清液，将流动性沉淀用0.01 M pH值7.4的PBS复溶至原体积的1/10，得到金标抗体，然后将金标抗体按照800 μl的量均匀浸铺到30 cm长，6 mm宽的SB06玻璃纤维膜上，37℃烘干60 min，得到金标垫，干燥保存备用。

1.3.3 检测线和质控线的确定

将黄曲霉毒素总量全抗原用0.01 M pH值7.4的PBS稀释成5个浓度梯度，分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml，在AE99硝酸纤维素膜用划膜仪划线，作为检测线；将羊抗鼠抗体用0.01 M pH值7.4的PBS稀释成5个浓度梯度，分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml，在AE99硝酸纤维素膜用划膜仪划线，作为质控线，37℃烘干20 min，得到预包被的硝酸纤维素膜，干燥保存备用。根据线条的颜色深浅确定合适的检测线和质控线浓度。

1.3.4 检测卡的组装

将SB06玻璃纤维膜裁剪成2 cm×30 cm的条子，作为样品垫；将BL-1吸水纸裁剪成2 cm×30 cm的条子，作为吸水垫。然后将样品垫、金标垫、预包被的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴到PVC底板上进行组装，最后切割成4 mm宽的条子，放进金标卡壳中，压紧为检测卡，干燥保存。

1.3.5 检测卡的最低检测限确定

1.3.5.1 样品处理方法

称取(2±0.05)g粉碎样本于50 ml离心管中;加入10 ml 20%甲醇水溶液，2 000 r/min振荡提取1 min，4 000 r/min离心5 min;吸取上层溶液待检。

1.3.5.2 检测卡的最低检测限确定

检测限指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。取检测卡检测阴性羊饲料、10 μg/kg标准添加样品、20 μg/kg标准添加样品、30 μg/kg标准添加样品、50 μg/kg标准添加样品、1 000 μg/kg标准添加样品、5 000 μg/kg标准添加样品各50份，确定检测卡的最低检测限。

1.3.6 检测卡的稳定性试验

取3个批次各30条检测卡置于37℃，测定时间为第7 d、第14 d、第28 d、第56 d、第77 d、第91 d、第120 d。查看检测卡的显色情况和样本测试情况，判定检测卡的稳定性，从而推断保质期。

1.3.7 检测卡的特异性试验

特异性反应指检测卡检测黄曲霉毒素总量和其他毒素类及其他族的被检物质（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素、赭曲霉毒素、氯霉素、恩诺沙星、青霉素）时表现出的一系列反应，通常用交叉反应率来表示，交叉反应率越低表明特异性越强。

1.3.8 检测卡的假阳性率试验

取3批检测卡，分别是LD120407、LD120409、LD120420检测卡，每批检测卡检测阴性空白羊饲料、10 μg/kg添加混合标准（黄曲霉总类的各物质浓度均为1 mg/ml）的羊饲料各50份，计算检测卡的假阳性率。

1.3.9 检测卡的假阴性率试验

取3批检测卡，分别是LD120407、LD120409、LD120420检测卡，每批检测卡检测20 μg/kg添加混合标准的羊饲料、50 μg/kg添加混合标准的羊饲料各50份，计算检测卡的假阴性率。

2 结果与分析

2.1 胶体金溶液的鉴定

图1 胶体金溶液电镜鉴定

由图1可见，加胶体金颗粒大小比较均匀、形状为圆形，经计算该胶体金颗粒的大小为22 nm，符合胶体金颗粒制备和单克隆抗体标记的要求。

2.2 抗体的标记

图2 抗体标记蛋白浓度的确定

图2的结果显示，当加入抗体蛋白的量为0～10 μg/ml抗体蛋白时，试管中的颜色为灰色和紫红色，表明加入的抗体蛋白量不足；当加入抗体蛋白量大于等于20 μg/ml的时候，试管中的颜色刚好趋于稳定的红色，表明加入的抗体蛋白量正好可以饱和吸附胶体金，在此基础上再加上20%，即24 μg/ml为合适的抗体蛋白添加量。

2.3 检测线和质控线的确定

表1结果显示，从经济角度讲，质控线浓度应选择0.4 mg/ml或者0.6 mg/ml，检测线为0.6 mg/ml作为最佳的检测线浓度。

表1 检测线和质控线的确定

2.4 试纸条的组装

图3 试纸条的组装

图3为试纸条的组装示意图，样品垫、金标垫、预包被的NC膜、吸水垫依次粘贴到PVC底板上进行组装，即为试纸条，将试纸条切割成4 mm宽的条子，放进塑料卡壳中，压紧为检测卡。

2.5 检测卡技术参数

2.5.1 检测卡的最低检测限确定

图4 结果判定

表2 检测卡的最低检测限确定

根据图4的阴阳性结果判定，由表2可知，本黄曲霉毒素总量检测卡针对黄曲霉毒素B1的检测限为10 μg/kg，与黄曲霉毒素其他结构的交叉反应率均大于20%，完全满足GB2761—81允许量20 μg/kg标准规定。

2.5.2 检测卡的保质期

图5 检测卡的保质期测定

图5显示的是1～7分别为置于37℃第7 d、第14 d、第28 d、第56 d、第77 d、第91 d、第120 d的检测卡显色情况，可知黄曲霉毒素总量检测卡在37℃下存放超过91 d以后，检测线和质控线的颜色深度变浅，偏离了原来的线条深度，据阿伦尼乌斯公式ln(k2/k1)=-Ea/R(1/T2-1/T1)推算，可知在37℃下存放77 d相当于常温存放18个月，这说明检测卡在18个月的常温存放下对整体质量的影响并不明显，故该检测卡的保质期为18个月。

2.5.3 检测卡的特异性

由表3可以看出，黄曲霉毒素总量检测卡对黄曲霉毒素类的交叉反应率大于等于20%，而与不同族的其他物质的交叉反应率小于1%，故该检测卡对黄曲霉毒素总量的特异性最强。

表3 检测卡的特异性

2.5.4 检测卡的假阳性率

表4 三批黄曲霉毒素总量检测卡假阳性率测定

表4显示，100份批号为LD120407的检测卡测试空白羊饲料和5 μg/kg添加羊饲料，只有一份为阳性，说明批号为LD120407的检测卡的假阳性率为1%，经计算，批号为LD120409和LD120420的检测卡的假阳性率分别为3%和1%。

2.5.5 检测卡的假阴性率

表5 三批黄曲霉毒素总量检测卡假阴性率测定

表5显示，批号为LD120407的检测卡测试10 μg/kg添加羊饲料和20 μg/kg添加羊饲料的结果全部为阳性，说明批号为LD120306的检测卡的假阴性率为0%，经计算，批号为LD120409和LD120420的检测卡的假阳性率分别为0%和0%。

3 结论

本研究的定性测定羊饲料中黄曲霉毒素总量残留的高灵敏度检测卡，对黄曲霉毒素B1的交叉反应率为100%，而与同族的其他物质的交叉反应率大于等于20%，与不同族的其他物质的交叉反应率小于1%，最低检测限为10 μg/kg。假阳性率小于5%，假阴性率为0%，密封好的检测卡常温下储存，保质期18个月。本卡可快速准确地应用于羊饲料中黄曲霉毒素总量残留的定性检测，为快速准确地满足定性测定羊饲料中黄曲霉毒素总量残留。