地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白工艺研究

■楚 杰 郭 刚 王君高刘可春

（1.山东省科学院生物研究所，山东济南 250014;2.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南 250353）

羽毛主要来源于禽类养殖加工业的副产品，现在国内的羽毛年产量近百万吨，随着我国禽类养殖加工业的快速发展，羽毛的产量将越来越大。羽毛中，蛋白质含量十分丰富，粗蛋白含量可达到80%以上，然而，由于羽毛中的蛋白主要为角蛋白，角蛋白中含硫氨基酸含量很高，所以，角蛋白分子内和分子间除了广泛存在着氢键、盐键、范德华力等交联作用外，还大量存在着二硫键，一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，主要作用位点在精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸等疏水氨基酸处，而没有断裂二硫键的能力，使得羽毛蛋白很难被这些蛋白酶所降解，对于产量逐年增长而在自然环境下降解很缓慢的羽毛，这对环境是个严重的负担，所以，以降解角蛋白为主要出发点的研究不仅具有重要的社会意义和经济价值，对环境保护也有很重要的意义。

目前，虽然国内外对羽毛蛋白的利用做了大量的研究，卢智文(1996)利用地衣芽孢杆菌PWD-1好氧和厌氧发酵得到羽毛降解物添加在肉鸡的日粮中，对羽毛降解物对肉鸡生长的影响进行了研究；Balázs Bálint等（2005）通过两步发酵法，利用地衣芽孢杆菌KK1好氧发酵得到的羽毛蛋白降解物，通过一厌氧的古细菌-Thermococcus litoralis生物制氢。K.W.Catanch等（2007）对羽毛粉及羽毛粉和血粉的混合物在瘤胃和小肠内的消化情况进行了研究；为了更方便更经济的研究羽毛粉在反刍动物体内的消化情况，S.Calsamiglia等(1995)建立起一个体外评估羽毛粉在瘤胃动物中消化情况的方法，但这些研究的基础是首先得到高含量可消化蛋白的羽毛粉产品，目前，这方面的研究虽然有一些，如，Xin Zhang（2011）对枯草芽孢杆菌液体发酵羽毛粉的发酵工艺进行了优化，以获得高可溶性蛋白含量的羽毛粉；Richa Jain等（2011）对脱叶链霉菌CFS1068降解羽毛的特性进行了研究。

地衣芽孢杆菌S6是本实验室筛选出的一株高产角蛋白酶活力的菌株（2012），具有较强的降解羽毛蛋白的能力，本试验通过单因素试验、正交试验设计，对地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白的工艺研究，以期提高羽毛蛋白中可溶性蛋白含量，为羽毛蛋白的充分利用奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

地衣芽孢杆菌S6本实验室保存。

1.1.2 培养基

斜面培养基（g/l）：酵母粉0.5，蛋白胨1.0，氯化钠1.0，pH值7.0；初始培养基（g/l）：羽毛粉10.0，K2HPO4/KH2PO4为 1.4/0.7，氯化钠 0.3，硫酸镁 0.1，pH值7.0，在此基础上分别进行含水量和pH值的单因素试验，121℃灭菌20 min。初始接种量1 ml芽孢悬液，约含有为108个芽孢。

1.1.3 羽毛粉

自来水洗净羽毛，70℃烘干，粉碎，过100目筛。

1.1.4 主要仪器

超净台、灭菌锅、培养箱、烘箱、离心机、分光光度仪、pH计。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白测定

称取一定量的发酵后的培养基，每克培养基加蒸馏水5 ml，震荡1 min后，取2 ml羽毛蛋白粉悬液，可溶性蛋白的后续测定步骤参照郭刚等（2012）的方法。

1.2.2 pH值测定

pH值测定采用pH计测定。

1.2.3 含水量单因素试验

以初始培养基为基础，含水量分别为40%、50%、60%、70%，37 ℃，100 r/min，发酵24 h，测定可溶性蛋白含量。

1.2.4 菌量单因素试验

以初始培养基为基础，芽孢量分别约为106、107、108、109个，每个梯度设计3个重复，37 ℃，100 r/min，发酵24 h，测定可溶性蛋白含量。

1.2.5 pH值单因素试验

以初始培养基为基础，pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0，每个梯度设计3个重复，37 ℃，100 r/min，发酵24 h，测定可溶性蛋白含量。

1.2.6无机盐正交试验

以初始培养基为基础，pH值为7.5，芽孢接种量为108个，含水量为60%，(K2HPO4/KH2PO4)浓度梯度(g/l)为：1.8/0.9、1.4/0.7、1.0/0.5；硫酸镁浓度梯度(g/l)为：0、0.1、0.2，氯化钠浓度梯度（g/l）为：0、0.3、0.6，每个梯度设计3个重复，37 ℃，100 r/min，发酵24 h，测定可溶性蛋白含量。

1.2.7 地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白发酵特性研究

以单因素试验和无机盐正交试验优化得到的培养基为地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白的培养基，37℃，100 r/min条件下培养，每24 h取样一次，测定可溶性蛋白，pH值，每个样设重复3次。

2 试验结果与分析

固体发酵技术是一种古老的发酵技术，与液态发酵相比，其设备要求简单，且其含水量低，产生的废水少，对环境污染少，许多产品的得率比较高，能较大的降低成本，所以，固体发酵技术越来越为人们所重视，本试验通过单因素试验和正交试验，对地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白的工艺进行了优化。

2.1 单因素试验

2.1.1 不同含水量对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响

图1 不同含水量对菌株S6降解羽毛蛋白的影响

从图1可以看出，含水量对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的效果影响非常大，在含水量为40%时，可溶性蛋白含量为50.31 μg/ml，在含水量为60%时，可溶性蛋白含量达到最高，为189.57 μg/ml，是含水量40%时可溶性蛋白量3.76倍。此外，在含水量不高于60%时，可溶蛋白含量随着含水量的升高而升高，然而，在含水量高于60%时，可溶性蛋白含量会快速降低，这可能因为在含水量低于60%时，羽毛粉的膨胀比较低，不利于地衣芽孢杆菌S6吸收营养物质（李小会等，2009），并且，较低的含水量还会造成芽孢外的渗透压较高，不利于芽孢萌发，而随着含水量的升高，过高的含水量会降低羽毛粉基质内的传氧效率，抑制了地衣芽孢杆菌S6的生长代谢，进而影响了其分泌角蛋白酶降解羽毛蛋白的效果。

2.1.2 不同菌量对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响（见图2）

图2 不同接种量对菌株S6降解羽毛蛋白的影响

在发酵过程中，可溶性蛋白的含量变化是一个动态变化的过程，主要受到地衣芽孢杆菌S6消耗利用和其降解速率的影响，而菌量在其中起着关键作用，菌量较低时，虽然消耗利用的可溶性蛋白量较少，但是其降解羽毛蛋白的能力也比较低，而随着菌量的升高，虽然其降解羽毛蛋白的能力提高了，同时其消耗可溶性蛋白的量也随之上升，此外，试验中的发酵环境对地衣芽孢杆菌S6生长代谢情况影响的同时，地衣芽孢杆菌S6在生长代谢过程中也会影响到发酵环境的变化，从本质上说，地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的过程是一个角蛋白酶酶解羽毛蛋白的过程，而酶活力的发挥受环境因素的影响很大，所以，一个合适的菌量水平对羽毛蛋白的降解是十分重要的，从图2可以看到，当菌含量在较低水平时，如1×106CFU/ml、1×107CFU/ml时，经24 h发酵后的羽毛粉中可溶性蛋白含量比较低，随着菌量的上升，可溶性蛋白含量也随着上升，但是菌量在1×108CFU/ml和1×109CFU/ml水平时可溶性蛋白含量差距很少，这可能是因为在这两个菌量水平上，二者消耗和降解羽毛蛋白的水平不一样，使得发酵体系中可溶性蛋白的含量处在一个相当的水平，同时这也说明，发酵体系中，可溶性蛋白的含量和菌量之间的关系不是线性的。

2.1.3 不同pH值对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响（见图3）

图3 不同pH值对菌株S6降解羽毛蛋白的影响

在发酵过程中，无论对于地衣芽孢杆菌S6的生长代谢，还是羽毛蛋白的降解，pH值都是一个影响其速率的关键因素，pH值不仅会影响到角蛋白酶的构象，合适的pH值可以使角蛋白酶处于一个更利于结合角蛋白的构象，还会影响到角蛋白酶和角蛋白的解离状态，在二者结合后便于角蛋白处于过渡态，此外，pH值还会影响到无机离子的浓度，如，当pH值过高时，会造成Mg2+、Ca2+等离子的沉淀，而这些离子，不仅对于地衣芽孢杆菌S6的生长代谢是必需的，并且，对于角蛋白酶降解羽毛蛋白也有很大影响，如Ca2+在稳定角蛋白酶中具有重要作用，从图3可以看出，pH值在7.5时，最有利于地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白。

2.2 无机盐正交试验

无机盐除了维持地衣芽孢杆菌S6渗透压之外，还是地衣芽孢杆菌生长代谢过程中一些大分子的组成部分，一些关键酶的辅基或者辅酶，本试验通过正交试验，来分析磷源、硫酸镁、氯化钠对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白效果的影响。正交设计及正交试验结果见表1、表2。

表1 无机盐正交试验设计

从表2可以看出，经过24 h的发酵，第1组的效果最差，可溶性蛋白含量只有123.13 μg/ml，这可能是因为无机盐水平太低，不能满足地衣芽孢杆菌S6的生长代谢需要，甚至是无机盐浓度水平太低，不能达到地衣芽孢杆菌S6生长代谢中某些关键反应所需要的最低浓度水平，第9组试验效果最好，经过24 h的发酵，可溶性蛋白达到207.95 μg/ml。

表2 正交试验结果

依据表2中的各无机盐正交试验的结果，考察的无机盐之间的极差为RA＞RB＞RC，即磷源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响最显著，其次为硫酸镁，氯化钠的影响最小，对于磷源，κ3最大，即(1.8/0.9)g/l时对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白效果最好，对于硫酸镁，κ3最大，所以硫酸镁在0.2 g/l时，最有利于羽毛蛋白的降解，氯化钠κ3与κ2大小相差很小，从经济角度考虑，本试验氯化钠的浓度水平选择为0.3 g/l，即本试验得到各因素之间的最佳组合为A3B3C2，各因素的最优水平为磷源(1.8/0.9)g/l，硫酸镁0.2 g/l，氯化钠0.3 g/l。

2.3 地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白特性研究

基于单因素试验和正交试验的结果，对地衣芽孢杆菌S6固体发酵羽毛蛋白的特性进行研究，每24 h一取样，测定可溶性蛋白及pH值变化情况，结果见图4。

从图4可以看出，随着发酵的进行，发酵体系中可溶性蛋白渐渐上升，在发酵进行了3 d后，可溶性蛋白含量快速上升，在96 h达到最大值，3 236 μg/ml，然后，可溶性蛋白含量渐渐的降低。发酵体系中的pH值随着发酵的进行，pH值在发酵的前48 h上升比较迅速，48 h时pH值达到最高，为8.37，随后pH值开始降低，并在8.0附近维持较长时间，这可能是因为pH值8.0附近更适合地衣芽孢杆菌S6的生长，或者pH值8.0附近更有利于地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白，以为其自身生长提供充足的可溶性蛋白量。与地衣芽孢杆菌S6液体发酵羽毛蛋白相比（郭刚等，2012），本试验接种的为地衣芽孢杆菌S6的芽孢，省去了活化菌种的步骤，为以后缩短了发酵周期的研究提供了很好的方向，此外，在可溶性蛋白的最大值点，也要比液体发酵羽毛蛋白的可溶性蛋白含量要高，不过，液体发酵羽毛蛋白可溶性蛋白最大值点和pH值最高值点在同一时间达到最大值，而固体发酵羽毛蛋白可溶性蛋白最大值点和pH值最高值点达到的时间不一样。

图4 可溶性蛋白及pH值随发酵过程变化曲线

3 讨论

本试验通过单因素试验和正交试验，确定了地衣芽孢杆菌S6的发酵条件：初始含水量为60%，接种量为108CFU/ml芽孢，初始pH值为7.5，发酵无机盐水平为磷源(1.8/0.9)g/l，硫酸镁0.2 g/l，氯化钠0.3 g/l。通过直接接种地衣芽孢杆菌S6的芽孢，与液体发酵相比，省去了活化菌种的步骤，为以后缩短发酵周期的研究提供了方向，此外，可溶性蛋白的含量也得到了提高，对更充分的利用羽毛蛋白有一定的现实意义。

（参考文献10篇，刊略，需者可函索）