嗜盐嗜碱菌株2 0-1 3的生物学特性及系统发育学分析

王 爽，王玉峰

（黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，黑龙江省土壤环境与植物营养重点实验室，哈尔滨 150086）

极端微生物或嗜极微生物（Extremophile）作为地球上的一种边缘生命现象，具有独特的基因类型、特殊的生理机制及多样化的代谢产物，不仅在农业、食品、医药、轻化工、环境和能源等领域显示出广泛的应用前景，而且在生命起源、系统进化和环境适应等方面具有重要启示作用[1]。

嗜盐微生物（Halophilie）是极端微生物的重要类群之一，由于具有特殊的细胞学、生理学和生物化学等特征而受到国内外学者的重视[2]。根据对盐浓度的需求和耐受程度不同，可将嗜盐微生物分为轻度嗜盐菌（Slight halophile）、中度嗜盐菌（Moderate halophile）和 极 端 嗜 盐 菌（Extreme halophile），遍布于细菌、古菌和真核生物三个域中，在食品、医药、化妆品、农业、环境等各领域具有广泛的应用[3]。盐土环境中的主要细菌类群为盐单胞菌科（Halomonadaceae）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae），对高盐土壤中植物生长有间接的促进作用[2,4]，其耐盐相关基因可考虑用作构建耐盐微生物和植物资源，对盐碱地的农业生产具有潜在价值。

嗜碱菌（Alkaliphiles）最适生长在pH 8.0以上，通常为pH 9～10的一类微生物。分为兼性嗜碱菌（Facultative alkaliphiles）和专性嗜碱菌（obligate alkaliphiles）[5-6]。不同类型的嗜碱菌已从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到[7]，被广泛应用于发酵工业中多种酶制剂的生产。嗜盐嗜碱菌主要分布于高盐高碱环境中，如从Magadi湖分离到的液泡嗜盐碱杆菌（Natronobacterium vacuolata）和格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi），从我国西藏碱湖中分离到的特腊帕尼盐杆菌（Halobacterium trapanicum）和亚洲嗜盐碱杆菌（Natrialba asiatica）等[8]。

大庆市位于黑龙江省西部、松嫩平原中部，地处我国八大土地盐渍化区中的东北半湿润-半干旱草原-草甸盐渍区，独特的地理气候特征和多样的盐渍土类型赋予该地区丰富的嗜盐微生物资源。本课题组在对大庆盐碱土嗜盐菌多样性研究过程中发现一系列可培养的中度嗜盐菌[9]。本研究对其中一株中度嗜盐菌菌株20-13进行初步分类鉴定，报道了采用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析方法对嗜盐菌株20-13的研究结果，旨在为20-13的后续应用奠定理论基础。

2 材料与方法

2.1 样品采集与菌株的分离、纯化

土壤样品于2007年4月采自大庆苏打盐碱土，取0～15cm深度的土壤，土样过2 mm孔径筛后进行梯度稀释，涂布在含20%NaCl（W/V）的改良S-G平板上[10]，置于37℃温箱培养两周，反复划线直至获得纯菌落。

2.2 形态学特征

分离到的单菌落划线接种于含10%NaCl（W/V）的改良S-G固体培养基上37℃培养24 h，观察菌落颜色、大小、边缘和表面隆起等特征。革兰氏染色采用Dussault的方法[11]。BX5-1普通光学显微镜（Olympus）观察细胞形态。

2.3 生理生化特征

参考Meta等方法[12]和《常用细菌鉴定手册》[13]，测定项目包括生长所需NaCl浓度、pH、温度的范围及最适值，发酵糖产酸，氧化酶、过氧化氢酶活性，硝酸盐还原，淀粉、明胶、酪素水解，产H2S试验等。

2.4 16S rRNA基因序列分析

采用CTAB法抽提细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，采用16S rRNA通用引物进行PCR扩增菌株20-13的16S rRNA基因[14]。纯化PCR产物，连接pMD18-T载体，转化E.coli Top10高效感受态细胞，筛选阳性克隆送交北京华大基因科技有限公司测序。测得的16S rRNA序列通过BLAST软件中的“nucleotide blast”与GenBank数据库中的已知序列进行比对，得出试验菌株与相关菌株之间的16S rRNA序列相似性。再用ClustalW2软件包进行多序列匹配排列（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/）。采用MEGA 4.0软件构建系统发育树[15]。删除序列匹配排列中的插入和缺失，根据“Kimura双参数”方式，通过序列数据计算进化距离。选择邻近连接法（Neighbour-joining）对系统进化树进行估算，通过1 000次取样确定其Bootstrap值。

3 结果与分析

3.1 形态学特征鉴定结果

分离株20-13形成圆形、边缘完整、表面微凸起、不透明的乳白色光滑菌落，在含20%NaCl（W/V）的改良S-G平板上菌落直径为0.6～1.2 mm（图1a）。细胞为革兰氏阴性的杆状，大小为0.3～0.5×3～5 μm，借助于周生鞭毛运动（见图1b），膨大的芽孢位于顶端（见图1c）。

图1 菌株20-13的形态照片Fig.1 Morphological picture of strain 20-13

3.2 生长和生理生化特征鉴定结果

菌株20-13生长NaCl范围1%～25%（W/V），最适为3%（W/V）；生长pH范围8.0～11.0，最适pH 10.0；生长温度范围20～50℃，最适为30～32℃；氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性；不能水解Tween 20、 Tween 40、Tween 60 和 Tween 80；可产生H2S；不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；可水解明胶、酪素和淀粉；不能由葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖和松三糖产酸。菌株20-13与碱杆菌属（Alkalibacillus）模式菌株的差异见表1。

表1 菌株20-13与碱杆菌属（Alkalibacillus）其他种的模式菌株特征比较Table 1 Characteristics of strain 20-13 and the type strains of other Alkalibacillus species

3.3 16S rRNA序列分析

利用PCR扩增获得1 563 bp大小的16S rRNA基因序列，提交至GenBank数据库的注册号为JQ926742。与NCBI数据库中已有序列的比对结果表明，菌株20-13与碱杆菌属（Alkalibacillus）同源性最高，分别为A.filiformis 99.4%、A.haloalkaliphilus 99.3%、A.silvisoli 98.6%、A.flavidus 96.6%、A.salilacus 96.4%、A.halophilus 96.2%。采用邻近连接法构建的系统进化树如图2所示。

图2 用邻近连接法构建的菌株20-13与其它相关模式菌株的16S rRNA基因序列系统进化树Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences from strain 20-13 and other related type strains.

4 讨论与结论

碱杆菌属（Alkalibacillus）包括6个有效种（http://www.bacterio.cict.fr/），分 别 为 A.filiformis、 A.flavidus、 A.haloalkaliphilus、 A.halophilus、 A.salilacus和 A.silvisoli，其中 A.haloalkaliphilus是芽孢 杆 菌 属（Bacillus）的一 新 种（B.haloalkaliphilus），后来经再分类并入碱杆菌属，并定义为该属的典型种[20]。

根据16S rRNA序列同源性构建系统进化树可判断微生物物种之间亲缘关系的远近，如果16S rRNA序列同源性低于98%，认为属于不同的种；同源性为93%～95%，认为属于不同的属[21]。通过对菌株20-13生长特性的研究可知，该菌株为嗜碱的中度嗜盐细菌，在所测定的形态学特征、生理学特征、生化和酶学特征及营养要求等方面，菌株20-13与碱杆菌属（Alkalibacillus）的A.filiformis基本一致，基于16S rRNA基因序列的系统进化分析也进一步证明菌株20-13与碱杆菌属的A.filiformis序列相似性最高（99.4%），因此两者应为同一个种。

利用纯培养方法分离获得的菌株20-13经形态学特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，菌株20-13为碱杆菌属（Alkalibacillus）的成员，在种的水平上最终确定为Alkalibacillus haloalkaliphilus。

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