间甲苯酚优势降解菌的筛选及降解性能研究

单德鑫，付秋玥，丁 丽

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

酚类物质是煤气废水中有机污染物的主要成分，约占总有机物的60%～80%。通过使用色质联用技术对哈尔滨某气化厂有机物进行分析，测得原水中的酚类物质达19种[1]。煤气站循环水中挥发酚的含量高达1 500～3 200 mg·L-1，以褐煤为燃料的废水含酚量为500～6 000 mg·L-1，而国家排放标准酚的最高允许排放浓度0.5 mg·L-1[2]。随着污水排放标准的不断提高，煤气废水的处理已受到越来越多的关注。

活性污泥法是当前应用最为广泛的处理煤气废水中酚类物质的方法之一，其中，向活性污泥处理系统中投放高效酚降解菌，能够大大提高微生物系统对酚的耐受能力，进而提高酚的去除率和降解速率，缩短处理时间[3]。

以哈尔滨某气化厂生化车间活性污泥为菌源，在不同浓度间甲苯酚无机盐培养基上培养，筛选出间甲苯酚优势降解菌并对其降解性能进行研究，为生物强化高效优势菌技术在废水处理应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

活性污泥取自哈尔滨某气化厂生化处理车间，试验所用废水为气化厂造气废水（原水）。

1.1.2 间甲苯酚无机盐培养基

培 养 基 是 以 K2HPO42.24 g·L-1，KH2PO42.74 g·L-1，(NH4)2SO41.00 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.2 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，FeCl3·6H2O 0.02 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1配制的间甲苯酚无机盐培养基，pH 7.4～7.6，于112℃灭菌20 min后，根据试验需要加入适量间甲苯酚制成唯一碳源培养基，备用。

1.2 方法

1.2.1 含酚量的测定

含酚量的测定采用4-氨基安替比林直接吸光光度法[4]。

1.2.2 菌液浓度的测定

菌液浓度以OD值表示，利用其在610 nm波长下有最大吸光度的方法进行测定[4]。

1.2.3 菌种的分离纯化与筛选

试验中，将废水与啤酒按1:9比例混合，使废水中的营养物质增加，然后在混合废水中加入一定量活性污泥，开始活性污泥的培养与驯化过程，连续曝气36 h。采用直接分离纯化法得到能够利用间甲苯酚作为唯一碳源的菌种。将各菌悬液按5%的比例分别加入到含间甲苯酚量为300、500、600 mg·L-1的无机盐培养基内，30 ℃，120 r·min-1条件下振荡培养，每隔3 h分别测定上述各培养液的间甲苯酚含量，计算各菌种在不同酚含量条件下间甲苯酚的降解率，从而确定其中的高效降解菌。

1.2.4 生长条件试验

在不同温度（15、20、25、30、35、40 ℃）、pH（3、5、7、9、12）和外加碳源（葡萄糖）浓度（0、300、500 mg·L-1）条件下，测定菌种对间甲苯酚的降解率，讨论各种外部条件对菌种降解能力的影响。

1.2.5 菌种鉴定

1.2.5.1 菌种形态观察

记录平板培养基上菌落的生长特征，液体培养基内是否呈混浊、絮状、粘液状，是否形成菌膜和沉淀等。

1.2.5.2 菌种生理生化鉴定

对所得菌种进行以下生理生化试验：革兰氏染色、接触酶、甲基红（M.R）、V-P测定、淀粉水解、葡萄糖氧化发酵、氧化酶、硝酸盐还原、产氨试验、产吲哚试验、明胶液化和石蕊牛奶试验。

1.2.5.3 菌种分子鉴定

对菌种进行分子鉴定，引物序列为16S F 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；16S R 5'GGCTA CCTTGTTACGACTT 3'。

取1～2 μL用于Promega公司pGEM-T Easy载体连接反应并转化大肠杆菌，挑取白斑摇菌后送北京市理化分析测试中心测序。将测得序列在GenB ank上进行Blast比对，根据所得测序结果，利用NCBI提供的Blastn工具在GenBank数据库中找到同源序列。

2 结果与分析

2.1 间甲苯酚优势降解菌的筛选

在平板培养基上共分离得到菌株27个，分别接种于含有不同浓度间甲苯酚的选择培养基上，30℃恒温培养48 h后，得到对间甲苯酚耐受能力最强的细菌2株，命名为JD-1和JD-2。

如图1所示，通过在不同间甲苯酚含量条件下，对JD-1、JD-2降解效果和降酚速率的比较可见，JD-2菌的降酚率明显高于JD-1，在含酚量为300、500和600 mg·L-1时，JD-2菌的降酚速率分别在9、9和27 h达到最大，降酚率分别为99.63%、99.59%、99.50%，表明该菌种具有较强耐负荷冲击能力；而JD-1对应时间则为9、33和30 h。因此，确定JD-2菌为间甲苯酚优势降解菌。

图1 不同间甲苯酚含量的条件下JD菌的降解速率Fig.1 Degradation rate of JD bacteria on the different concentrations of M-cresol

2.2 降解菌的特性研究

2.2.1 温度对降酚效果的影响

由图2可知，间甲苯酚优势降解菌JD-2的最适温度为30℃。

图2 温度对JD-2生长与降酚率的影响Fig.2 Effects of temperature on growth and degradation efficiency of JD-2

2.2.2 pH值对降酚效果的影响

由图3可知，JD-2菌的最适pH范围为7～9，同时对间甲苯酚的降解效果较好，当pH值为11时，该菌株菌液OD仅为0.065，间甲苯酚的降酚率几乎为0，说明在强碱性的条件下，JD-2菌几乎不能生长。

2.2.3 外加碳源对降解效果的影响

由图4可知，加入一定浓度的葡萄糖溶液能够促进JD-2对间甲苯酚的降解作用，降酚率也有所提高。在前3 h，加入500 mg·L-1葡萄糖的培养液降酚率高于含葡萄糖量为300 mg·L-1，其降酚率分别为39.35%和32.34%，未加入葡萄糖溶液的无机盐培养基内降酚率仅为26.30%，随后，含葡萄糖量为300 mg·L-1培养液的降酚率逐渐提高，12 h后降酚率达到98.99%，明显高于其他两组培养液。由碳源降解试验可知，JD-2菌不仅能够利用间甲苯酚作为唯一碳源，而且能够利用其他物质（如葡萄糖）作为碳源，促进间甲苯酚的降解。

图3 pH值对JD-2生长及降酚率的影响Fig.3 Effects of pH on growth and degradation efficiency of JD-2

图4 不同碳源量对JD-2菌降酚效果的影响Fig.4 Effects of different carbon source concentration on degradation efficiency of JD-2

2.3 菌种鉴定

2.3.1 菌种形态特征观察

JD-2菌在琼脂平板上呈乳脂状，为乳白色，半透明，单菌落为圆形，边缘为锯齿状，脐状凸起，菌体湿润光滑，易挑起；在液体培养基内能够均匀生长，不形成菌膜，无沉淀。

2.3.2 菌种生理生化鉴定

间甲苯酚优势降酚菌JD-2，在革兰氏染色试验中呈阴性，能够氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛奶产碱变蓝。其他生理生化试验结果见表2。

2.3.3 菌种的分子鉴定

菌株JD-2基因测序结果与GenBank数据库中序列比对结果表明，该菌株的基因序列与在Genbank数据库中登记的多株假单胞菌属的菌株具有高度同源性，同源性均在99%以上，见表3。其中与该菌株同源性最高的是Pseudomonas sp.SMIC-5，同源性达100%。由16S rRNA测序鉴定结果可知，间甲苯酚优势降解菌JD-2为假单胞菌属。

表2 生理生化试验结果Table 2 Results of physiological and biochemical experiment

表3 JD-2菌16S rRNA序列Blast结果Table 3 JD-2 strain 16S rRNA sequence blast

3 讨论与结论

本研究通过富集培养方法，从气活性污泥中分离一株高效间甲苯酚降解菌，这种方法通过不断提高富集时间甲苯酚的浓度，使降解能力强、对间甲苯酚耐受力强的菌株得到选择性生长，并且富集过程稀释了污泥中有机质的含量，使后期在含间甲苯酚的选择培养基上筛选间甲苯酚降解菌可行。以间甲苯酚为基质，通过筛选高效降解菌和对基质共代谢技术处理含酚废水进行研究，了解最佳降解条件，以期为工程应用提供理论基础。

以间甲苯酚作为基质，从活性污泥中分离筛选出对间甲苯酚耐受能力最强的2株菌命名为JD-1和JD-2。由间甲苯酚含量分别为300、500、600 mg·L-1的降解试验对比结果可知，JD-2菌的降酚率和降酚速率均明显高于JD-1，由此确定，JD-2菌为间甲苯酚优势降解菌。

在36 h试验时间内，含酚量为300、500、600 mg·L-1的条件下，降解速率达到最高水平所用时间分别为9、9、27 h，经过36 h的降解，降酚率分别为99.63%、99.59%、99.50%。本试验培养的间甲苯酚优势降解菌JD-2对间甲苯酚具有较强的耐负荷冲击能力。

由特性研究结果可知，菌株JD-2在6～18 h均保持良好活性，其最佳降解条件为温度为30℃，pH 7～9，葡萄糖量500 mg·L-1。同时可知，加入一定浓度的葡萄糖溶液对酚类物质的降解有良好促进作用。经一系列生理生化试验鉴定和16S rRNA测序比对，初步判断菌株JD-2为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

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