氮溴化丙锭与聚合酶链反应结合的细菌活细胞检测方法

史 菊（江苏省泗洪县人民医院，江苏 泗洪 223900）

叠氮溴化乙锭（EMA）不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合，最终阻断DNA分子的聚合酶链反应（PCR），可用于PCR检测中区分死活菌。但是，EMA具有细胞毒性，使其在临床诊断和食品安全中的应用受到一定的限制[1]。在细菌死活细胞的PCR选择性扩增中，使用无细胞毒性的PMA代替EMA与PCR结合，对PMA对细胞致死作用进行有效的分析，同时对PMA的抑制作用进行考察，分析在死细胞DNA的PCR扩增中，PMA交联受浊度、曝光时间以及最适浓度的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：菌种为大肠杆菌Escherichia coli ATCC 8739，运用LB液体培养在160 r/min、30℃下进行24 h的培养。试剂为PMA（美国Biotium公司）；细菌通用引物1492R（5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3′）和27F（5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′）；脱氧核糖核酸（dNTPs）、Taq酶等PCR反应体系（TaKaRa公司）。仪器用PCR仪器（Eppendorf公司）；Gel Doe 2000型凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。

1.2 方法：①试验样品：取24 h培养的E.coli菌悬液10 ml，5000 g离心5 min，两次悬浮1.5%的NaCl溶液，对其进行稀释得到108 ml-1的菌体细胞数；②PMA处理：用二甲亚砜溶解PMA，配置成0.5 mg/ml的PMA溶液，避光，保存于-20℃冰箱。取500μl的菌悬液，置于1.5 ml离心管中，然后加入3μl 0.5 mg/ml的PMA溶液，控制PMA的终质量浓度为3μg/ml；充分混匀，避光培养5 min。用500 W的卤素灯曝光，时间为5 min，在冰上放置光照交联的样品，距光源距离为20 cm；悬浮液交联后10000 g离心，时间为5 min，得出沉淀并提取DNA[2]。此外，对于活细胞、死细胞的PMA处理中，进行PMA处理的为试验组，而没有进行PMA处理的为对照组；③PMA曝光交联的浊度试验：3μl PMA分别为加入500μl浊度为0、1、5、10、50、100 NTU的热致死细胞悬浮液中，PMA的终质量浓度为3μl/ml，热致死细胞悬浮液未经PMA处理的为对照组。3 min光照后进行PMA曝光交联，对PMA光照交联受浊度的影响进行考察；④不同条件制备死细胞的PMA处理；⑤DNA提取与PCR反应：曝光交联PMA后，悬浮液10000 g离心，运用超纯水对沉淀进行两次重悬浮。对2×细胞裂解液进行加入，在沸水浴中煮沸10 min，使裂解细胞。悬浮液10000 g离心冷至室温后，在微量离心管中进行上清液的转入，保存温度为-20℃。PCR反应体系为50μl，5μl 10×PCR缓冲液，0.5μl正反向引物，5μl上述上清液，41.7 nmoL/s Taq DNA聚合酶，4μl脱氧核糖核苷酸，用超纯水补足体积。PCR反应的程序：第一步，预变性：温度是94℃，时间为5 min；第二步为30个循环：94℃，30 s变性；55℃，退火1 min；72℃，延伸1.5 min。用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，同SYBR Green I核酸染料对凝胶进行染色，通过Gel Doc2000凝胶成像系统进行成像。运用Image J软件，对琼脂糖凝胶上DNA条带密度进行定量分析[3]。

2 结果

2.1 死细胞的PMA处理：对于没有进行PMA处理的一组中，通过紫外灯照射、热、异丙醇处理，对E.coli死细胞进行获得，其DNA的PCR扩增差异并不明显。另一组试验对PMA处理进行了添加，得到的E.coli活细胞，其DNA的PCR扩增产物与上一组相比，条带密度相差甚微，依据这一点，可以得知PMA处理不会对E.coli活细胞DNA的PCR扩增造成影响。70%异丙醇处理10 min与75℃水浴10 min得到的E.coli死细胞，在PMA处理后，PMA会对其DNA的PCR扩增进行抑制，也就是说对于E.coli死细胞中DNA的PCR扩增，PMA具有较好的抑制能力。借助紫外灯进行10 min的照射，使E.coli细胞死亡，不过PMA处理死细胞后，PMA就不会对其DNA的PCR扩增造成影响。分析这一原因，主要是因为异丙醇、紫外照射与热造成的细胞死亡形成的原理有所差异，热和异丙醇通过处理会对生物细胞的细胞膜造成破坏使其死亡，而紫外照射的处理会使细胞中核酸的结构受到损害，但细胞膜不会受到大的影响，其中PMA无法透过完整的细胞膜，与DNA进行结合。

2.2 PMA处理热致死细胞/活细胞混合样品的效果：对照组中没有进行PMA处理，PCR产物的产量变化差异无统计学意义（P＞0.05）。试验显示，活菌受PMA的影响比较的小；如果活菌数＜50%，对照组与PMA处理组差异有统计学意义（P＜0.05），也就是说，E.coli热致死细胞中，可以通过PMA对DNA的PCR扩增进行有效的抑制[4]。

2.3 PMA光照交联受浊度的影响：通过分析可知，当浊度＜10 NTU时，对死细胞DNA的PCR扩增，PMA具备的抑制效用仍然有效；当浊度＞100 NTU时，PMA的抑制效果就会失去。对于PMA光照交联受浊度的影响而言，光的透过性影响较为重要，其随着浊度的增大，光的透性就会变得越弱，而DNA分子与PMA交联的能力也就会越来越弱。相关研究结合PMA和EMA定量PCR，对厌氧发酵污泥中死菌、活菌细胞数的分析过程中，借助EMA、PMA，对试验样品进行了处理，不过洗脱罐污泥的外观是深黑色的，这就使光线难以透过液体，曝光过程得到阻碍，也就对EMA、PMA与DNA的交联产生了影响，为此，样品中死细胞DNA的PCR扩增，无法通过EMA、PMA进行抑制。

3 讨论

通过PCR与PMA的结合，可以对异丙醇处理、检测热处理致细菌细胞膜破裂的细胞死亡进行选择，对于样品中的PMA而言，其质量浓度＞3μg/ml时，曝光时间就会超过3 min，浊度小于10 NTU时，对于死细胞DNA的PCR扩增，PMA处理就会起到较好的抑制作用。PMA质量浓度＞50μg/ml时，活细胞DNA的PCR扩增就会受到一定的影响，浊度＞100 NTU时，PMA的抑制作用就会失去效果。另外，在浊度对PMA光照交联的影响中，运用PMA与EMA结合的方法，进行厌氧发酵污泥中死菌和活菌细胞数量的分析中，得知即使通过PMA或EMA的处理，但由于洗脱罐污泥对光线的阻挡，时曝光过程中PMA或EMA与DNA的交联受到了限制，使样品中死细胞DNA的PCR扩增无法得到抑制。同时，由于EMA细胞毒性作用的影响，也就限制了EMA的有效应用，但通过无毒性的PMA与PCR相结合，其应用过程则更加安全适用。

[1]仝铁铮,吴舒旭,施汉昌,等.基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究[J].环境科学,2011,32(4):252.

[2]胡秀华,施汉昌,李 丹,等.水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建[J].环境科学,2008,29(2):111.

[3]司文会,訾言勤,屠一锋.吖啶黄反应光度法测定脱氧核糖核酸含量的研究[J].光谱学与光谱分析,2008,28(2):412.

[4]李晓岩,刘启才,彭 燕.腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测[J].环境科学学报,2007,27(5):785.