3-氯-1,2-丙二醇对睾丸间质瘤细胞R2C生物活性的影响

邹飞雁， 白 顺， 白卫滨， 孙建霞， 张 磊， 黄亚东， 孙伟伟

（1.暨南大学 发育与再生生物学系，广东 广州 510632；2.暨南大学 食品科学与工程系，广东 广州 510632；

3.广东工业大学轻工化工学院，广东广州510090；4.暨南大学 医药生物技术研究开发中心，广东广州510632）

食品在加工贮藏过程中易受到氯丙醇污染。添加不合卫生条件的酸水解蛋白质液，容易引起酱油、蚝油等调味品含有氯丙醇[1]。近几年在饮用水、发酵香肠、饼干、面包、烧煮鱼、肉制品及膨化食品中检出氯丙醇化合物[2]。此外，家庭烹饪热加工也会导致食物中氯丙醇的产生，危害人体健康。氯丙醇污染及残留已成为一个国际性食品安全问题，引起人们广泛关注[3]。氯丙醇主要有3-氯1，2-丙二醇、1，3-二氯-2-丙醇、2，4-二氯-1-丙醇、2-氯-1，3-丙二醇等几种同系物，其中3-氯1，2-丙二醇 （3-Monochloropropane-1，2-diol，3-MCPD）是最常见的氯丙醇类污染物之一。研究表明，氯丙醇具有一定的毒性作用，特别是3-MCPD，具有致癌性[4-5]。Sunahara[6]等人经过长期对大鼠的研究发现，喂食含3-MCPD的食物可能增加睾丸间质细胞瘤和乳腺癌的发病率，其具体的毒性机理目前还不明确，特别是体外的还未见相关报道。本研究通过3-MCPD对体外培养R2C细胞的毒性损伤情况，探讨氯丙醇引起雄性生殖毒性的机制，为氯丙醇的食品安全评价提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 R2C细胞（大鼠睾丸间质瘤细胞株）:由暨南大学医药生物技术研究开发中心提供；3-MCPD:上海晶纯公司；F12培养液、胰酶、胎牛血清、马血清、肌氨酸钠:美国Sigma公司；MTT、DMSO:美国 Amresco 公司；EDTANa2、Triton-X100、Tris:美国Genview公司；低熔点琼脂糖:美国FMC公司；正常熔点琼脂糖:西班牙Biowest公司；孕酮放免试剂盒:北京北方生物技术研究所。

1.1.2 仪器 CO2培养箱、酶标仪:美国Thermo公司；GC-1200γ放射免疫计数仪:安徽中科中佳公司；DDL-5低温离心机:上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT检测3-MCPD对R2C细胞增殖的影响R2C细胞培养至对数期，调整细胞浓度为2×104个/mL，96孔板内每孔接种200 μL细胞悬液。24 h后加入用无血清培养液稀释的3-MCPD溶液，使每孔终浓度分别为 0.5、1、2、4、6 mmol/L。 设有空白组 （无细胞）和对照组（无药物），每组设3个复孔。药物作用48 h 后，加入 20 μL、5 mg/mL 的 MTT。 作用 4 h 后吸去孔内液体，每孔加200 μL DMSO溶解沉淀，放于脱色摇床摇匀10 min后于酶标仪检测570 nm波长处的吸光值[7]。通过以下公式及SPSS软件分析3-MCPD 刺激细胞 48 h 后的 IC25、IC50、IC75。

细胞生长抑制率（%）=[1-（给药组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%

1.2.2 单细胞电泳检测3-MCPD对R2C细胞DNA损伤情况 调整对数期R2C细胞悬液的浓度为1×105个/mL，以每孔1 mL的细胞悬液接种到6孔板内。细胞培养24 h加入3-MCPD，使其终浓度为IC25、IC50和IC75。培养4 h后收获细胞，4℃冷却。

取0.8 g/dL正常熔点琼脂糖，加热熔化后，冷却至45℃，取100 μL滴于载玻片上，盖上盖玻片，4℃、10 min 后取下盖玻片。104个细胞与 75 μL、0.8 g/dL的低熔点琼脂糖溶液在37℃下混匀，迅速滴在第一层琼脂糖上，加上盖玻片，4℃、10 min后取盖玻片。玻片浸入预冷的裂解液 （2.5mol/LNaCl，100mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，1%Triton X 100 及 10%DMSO组成，临用前配用，pH 10），4℃保持1 h。 取玻片，蒸馏水洗3次后，放入电泳槽，加电泳液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13），电泳液面需高出玻片0.25 cm，静置20 min后于25 V、200 mA电泳15～20 min。取玻片置于 0.4 mol/L Tris（pH 7.5）溶液中洗涤 3次，每次10 min。避光滴加20 μL、25 μg/mL EB 染色， 盖上盖玻片后荧光显微镜下观察拍照。CASP软件分析电泳结果。

1.2.3 放射免疫法检测3-MCPD对R2C细胞合成孕酮的影响 对数期R2C细胞悬液以1×106/mL的密度接种到6孔板，每孔1 mL，培养24 h后，换上分别含IC25、IC50和IC75浓度3-MCPD的培养液，继续培养4 h或24 h后提取上清液，400 g离心5 min，-20℃保存。用放射免疫试剂盒检测上清液中的孕酮含量。

1.2.4 统计学处理 运用SPSS软件19.0进行统计分析，采用单因素方差分析结果，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3-MCPD对R2C细胞的生长抑制作用

不同浓度的3-MCPD作用R2C细胞48 h后，细胞生长受到不同程度的抑制。由图1可见，随着浓度的增加，细胞形态和数量均发生了变化。细胞形态逐渐变圆，且贴壁不稳定，随着浓度的增加，此现象越明显，同时细胞抑制率随着3-MCPD浓度的增大也逐渐增大，见表1。通过SPSS软件分析得出3-MCPD 对 R2C 细 胞 的 IC25、IC50、IC75分 别 为1.027、1.802、3.160 mmol/L。

图1 不同浓度3-MCPD刺激R2C细胞48 h后的细胞形态图（200×）Fig.1 Morphology ofR2C cells under different concentration of 3-MCPD for 48 h

表1 不同浓度3-MCPD对R2C细胞生长抑制率的影响Table 1 Inhibitory effect of 3-MCPD on R2C cells

2.2 3-MCPD对R2C细胞DNA损伤的作用

不同浓度3-MCPD刺激R2C细胞4 h后，细胞拖尾的长度随着浓度的增加而增长，见图2。通过CASP软件分析尾部DNA%、尾长、尾距以及Olive尾距等数据得出，见图3。IC75浓度组对细胞DNA有明显的损伤作用，具有统计学意义，而其他组与对照组相比没有显著性的变化。

图2 不同浓度3-MCPD刺激4 h后对R2C细胞DNA损伤作用Fig.2 Damage of DNAs in R2C cells after treatment with 3-MCPD

图3 不同浓度3-MCPD刺激4 h后对R2C细胞尾部DNA%、尾长、Olive尾距的影响Fig.3 Effect of 3-MCPD on head DNA （%），tail length and olive tail moment in R2C cells

2.3 3-MCPD对R2C细胞分泌孕酮的影响

RIA结果显示，不同浓度3-MCPD作用R2C细胞4 h后，IC75组能够明显影响细胞孕酮的合成，其他各浓度组与对照组相比对孕酮合成没有显著影响，见图4。而在作用24 h后，可见孕酮合成量显著降低，且随着浓度的增加，降低也更明显，见图5。

图4 不同浓度3-MCPD刺激4 h后对R2C细胞孕酮合成的影响Fig.4 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 4 h

图5 不同浓度3-MCPD刺激24 h后对R2C细胞孕酮合成的影响Fig.5 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 24 h

3 结语

生殖系统是氯丙醇主要的靶器官[8]，其中睾丸又是雄性生殖系统最主要的生殖腺。睾丸最主要的一个功能即睾丸间质细胞能够产生雄激素睾酮，睾酮对维持正常的雄性生理功能起到至关重要的作用。

本研究首先发现了R2C细胞在3-MCPD的刺激下生长明显受抑制，3-MCPD浓度在0～6 mmol/L范围内，其抑制细胞增殖的作用为5.99%～96.87%，表明了3-MCPD可能是通过抑制R2C细胞的增殖来影响生殖系统的正常运行。体外实验表明，3-MCPD及其代谢物缩水甘油对中国仓鼠卵巢细胞具有明显的DNA损伤作用[9]。本研究的SCGE结果显示， 浓度为 1.027、1.802、3.160 mmol/L 的 3-MCPD刺激R2C细胞4 h后，其中3.160 mmol/L刺激组，其尾部DNA%、尾长和Olive尾距分别增加342.6%、137.4%和409.7%，与对照组相比有统计学意义；而其余两组与对照组相比无明显统计学意义。这些结果显示，3-MCPD对R2C细胞也具有一定程度的DNA损伤作用。孕酮是睾酮合成的第一步，通过检测孕酮水平可间接说明睾酮的分泌量[10]。RIA的结果显示，浓度为1.027、1.802、3.160 mmol/L的3-MCPD刺激R2C细胞4 h后，其中有3.160 mmol/L刺激组合成的孕酮与对照组相比降低了16.0%，有统计学意义。3-MCPD继续作用细胞24 h后，各浓度组孕酮合成量与对照组相比分别降低9.5%、20.6%及61.2%，有统计学意义。

总之，3-MCPD对体外培养的R2C具有明显抑制增殖和DNA损伤作用，并降低R2C细胞合成的孕酮，进而影响睾酮合成。通过以上结果推测，3-MCPD可通过影响R2C细胞孕酮合成过程相关基因的表达来调节孕酮合成。但大多数学者认为3-MCPD属于非遗传毒性致癌物，在体内小鼠骨髓微核和大鼠肝非程序性DNA合成试验中，结果均为阴性[11]。目前对于体外试验中3-MCPD具有遗传毒性的解释有两种:一种认为3-MCPD在大鼠体内的主要代谢物为β-氯代乳酸，并没有产生缩水甘油等其他具遗传毒性的代谢物[4]；另一种认为3-MCPD能与体外的培养基中某些化合物反应，产物具有遗传毒性作用[12]，其具体作用机制还需要进一步研究讨论。

[1]张烨，丁晓雯.食品中氯丙醇污染及其毒性[J].粮食与油脂，2005，7:44-46.ZHANG Ye，DING Xiao-wen.Contaminant and toxicity of chloropropanol in food[J].Cereals and Oils，2005，7:44-46. （in Chinese）

[2]王卫华，徐锐锋，刘军，等.食品中氯丙醇测定方法研究进展[J].化学分析计量，2007，16（3）:74-76.WANG Wei-hua，XU Rui-feng，LIU Jun，et al.Progress in determination method of chloropropanols in food[J].Chemical Analysis and Meterage，2007，16（3）:74-76.（in Chinese）

[3]傅武胜，李敬光，张珙，等.我国市售酱油氯丙醇污染研究:地区间污染水平的比较[J].食品与发酵工业，2007，33（2）:92-96.FU Wu-sheng，LI Jing-guang，ZHANG Hong，et al.Occurrence of chloropropanols in soy sauce in retailer in China:comparison of the levels of chloropropanols of soy sauce from the various origins[J].Food and Fermentation Industries，2007，33（2）:92-96.（in Chinese）

[4]HWANG Myungsil，YOON Eunkyung，KIM Jayoung，et al.Toxicity value for 3-monochloropropane-1，2-diol using a benchmark dose methodology[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2009，53（2）:102-106.

[5]CHO W S，HAN B S，KIM C，et al.Carcinogenicity study of 3-monochloropropane-1，2-diol in sprague-dawley rats[J].Food Chem Toxicol，2008，46:3172-3177.

[6]Jones A R，Milton D H，Murcott C.The oxdative metabolism of alpha-chlorohydrin in the male rat and the formation of spermatoceles[J].Xenobiotica，1978，8:573.

[7]陈义勇，顾小红，汤坚.桦褐孔菌多糖的抗肿瘤活性研究[J].食品与生物技术学报，2011，30（1）:65-69.CHEN Yi-yong，GU Xiao-hong，TANG Jian.Study on anti-tumor activities of polysaccharides from Inonotus obliquus[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（1）:65-69.（in Chinese）

[8]李宁，刘泽钦，贾旭东，等.氯丙醇对大鼠的毒性研究[J].卫生研究，2003，32（4）:349-352.LI Ning，LIU Ze-qin，JIA Xu-dong，et al.Study on the toxicological effect of chloropropanols on rats[J].Journal of Hygiene Research，2003，32（4）:349-352.（in Chinese）

[9]Ramy R E，Elhkim M O，Lezmi S，et al.Evaluation of the genotoxic potential of 3-monochloro-propane-1，2-diol（3-MCPD）and its metabolites，glycidol and beta-chlorolactic acid，using the single cell gel/comet assay[J].Food Chem Toxicol，2007，45:41-48.

[10]ZHANG Qi-hao，ZOU Ping，ZHAN Hai-chao，et al.Dihydrolipoamide dehydrogenase and cAMP are associated with cadmiummediated Leydig cell damage[J].Toxicology Letters，2011，205:183-189.

[11]Piasecki A，Ruge A，Marquardtm H.Maligant transformation of mouse M2 fibro-blasts by glycerol chlorohydrines contained in protein hydrolysates and commercial food[J].Arzaneimit-Telforschung，1990，40（9）:1054.