食用鼠曲草黄酮的提取及体外抗氧化性研究

石青浩， 李 荣， 姜子涛

（天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

鼠曲草（Gnaphlium affine）俗称清明菜、追骨风、佛耳草，为菊科植物鼠曲草的全草，主要分布于我国华东、华中、华南、西南、西北、华北及台湾，以野生为主，可药用也可食用。全草含钙、钾、镁等微量元素，还含有氨基酸、黄酮类化合物、挥发油、豆甾醇、生物碱等[1-4]。具有降血脂、降血糖、降血压、抗衰老、消炎抑菌、增强免疫力等多种功效[5]。

文中探讨了微波提取鼠曲草黄酮的条件，并对微波提取的鼠曲草黄酮与抗氧化剂VC进行了体外抗氧化性能和清除自由基性能的比较研究，为鼠曲草资源在食品、保健品等领域的进一步开发利用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠曲草，安徽诚信药家有限公司提供；S-8大孔吸附树脂，购于南开大学化工厂；水（娃哈哈饮用纯净水），杭州娃哈哈集团有限公司出品；芦丁标准品（分析纯），北京化学试剂公司产品；DPPH:美国Sigma公司产品；抗坏血酸（VC）、结晶紫、磷酸钠、钼酸铵等均为分析纯，所用水为除氧蒸馏水。其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

MAS-Ⅰ型微波快速制样系统，上海新仪微波化学科技有限公司制造；U-3900 UV-Vis紫外可见分光光度计，日本日立公司制造；LGJ-10型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司制造；KQ2200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司制造；FA1104N型电子天平，上海精密仪器有限公司制造；RE 52-86A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂制造；80-1型离心机，上海手术器械厂制造；电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司制造；970CRT荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司制造；LRH-150S恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂制造。

2 试验方法

2.1 鼠曲草总黄酮的微波提取工艺

称取2.0 g鼠曲草粉末，固定微波功率500 W，以体积分数60%乙醇溶液为溶剂，放入微波玻璃反应器中，按 1∶60（g/mL）的料液比在 60℃下萃取 5 min，待提取液稍冷后进行过滤，滤液经石油醚萃取，去掉石油醚层，得鼠曲草黄酮的提取液，再经旋蒸后冷冻干燥，得到鼠曲草黄酮粉末。

试验以黄酮得率为指标，通过单因素试验来确定在固定微波功率为500 W下的乙醇体积分数、料液比、提取时间和温度等因素的试验范围，以得到微波辅助提取鼠曲草黄酮的最佳工艺参数。

2.2 黄酮含量的测定

首先以芦丁为标准品，采用比色法[6]，确定芦丁浓度c与吸光度A之间的标准工作曲线，A=13.09c+0.003，相关系数R2=0.999 8。然后，取2.0 mL黄酮提取液，同样按照文献[6]的方法进行显色后，以试剂空白作参比测定吸光度值，利用标准工作曲线计算出鼠曲草黄酮的得率（为从鼠曲草粉末中所提取的黄酮的质量与鼠曲草粉末质量之比）。

2.3 总抗氧化活性的测定－磷钼络合物法

取0.1 g鼠曲草黄酮粉末，用体积分数30%乙醇溶解定容到100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的鼠曲草黄酮储备液，用时用体积分数30%乙醇溶液稀释到所需浓度，配制VC溶液质量浓度为1.0 mg/mL作储备液。将储备液分别稀释成质量浓度为 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL 的黄酮溶液和VC溶液的样品液。由终浓度为0.6 mol/L硫酸、4.0 mmol/L钼酸铵和28.0 mmol/L磷酸钠的溶液配制成磷钼试剂。取4.0 mL磷钼试剂液和0.4 mL样品溶液于一系列10 mL的比色管中，迅速摇匀后在95℃水浴中恒温90 min。在695 nm波长下测定不同浓度样品溶液的吸光度A。平行测定3次，取平均值。方法详见文献[7-8]。

2.4 清除羟基自由基能力的测定－结晶紫法

将储备液稀释成质量浓度为0.05 mg/mL的鼠曲草黄酮溶液和VC溶液为样品液。取0.5 mL结晶紫 （0.4 mmol/L）、0.7 mL H2O2溶液 （5.0 mmol/L）和0.7 mL FeSO4溶液 （10.0 mmol/L）于一系列10 mL的比色管中。用磷酸氢二钠-柠檬酸溶液的缓冲溶液（pH 4.0）定容至 10.0 mL，摇匀并放置 30 min，在580 nm波长下测其吸光度Ab，同时测定不加双氧水时580 nm波长处的吸光度A0。羟自由基的产生量可以用△A=A0-Ab表示。方法详见文献[9]。

样品液对羟自由基清除率的测定:按照上述步骤在加 H2O2之前分别加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的样品液，测定其吸光度As，平行测定3次，取平均值。则样品溶液对羟自由基的清除率S为

2.5 清除超氧阴离子自由基能力的测定－邻苯三酚自氧化荧光动力学法

将储备液配制成质量浓度分别为0.3、0.5、1.0 mg/mL的黄酮溶液和VC溶液为样品液。方法详见文献[10]。

2.5.1 光谱条件的选择 向1 cm的石英比色皿中加入 2.2 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2）、0.1 mL 水和0.3 mL邻苯三酚（0.01 mol/L），混匀后立即扫描。设定灵敏度为2，Ex、Em缝宽为20，固定发射波长Em=508 nm，每隔两分钟在Ex=250～500范围内快速扫描，得到邻苯三酚随时间变化而变化的激发光谱。重新取液，固定激发波长Ex=444 nm，在Em=450～700 nm范围内每隔2 min扫描，得到邻苯三酚随时间变化的发射光谱。

2.5.2 邻苯三酚自氧化反应速率的测定 向1 cm的石英比色皿中加入2.2 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2）、0.1 mL 样品液和 0.3 mL 邻苯三酚（0.01 mol/L），混匀后在激发Ex=444 nm和发射Em=508 nm的波长条件下测定。利用3～7 min（每隔1 min测定值）以时间为横坐标、相对荧光强度为纵坐标作图，斜率为Vs（以0.10 mL水代替样品溶液得到V0），即邻苯三酚自氧化的反映速率。按下式计算抑制剂对O2-·的抑制率V为

2.6 清除DPPH自由基的测定

将储备液稀释成质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的鼠曲草黄酮溶液和VC溶液为样品液。取3.5 mL浓度为1×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL样品液于10 mL的比色管中，摇匀并放置30 min，倒入1 cm的石英比色皿，测定517 nm下的吸光度A。以3.5 mL DPPH溶液和0.5 mL体积分数30%乙醇溶液的混合液为参比，测定517 nm下的吸光度A1。同样方法测定3.5 mL无水乙醇和0.5 mL样品液混合后在517 nm下的吸光度A0，平行测定3次，取平均值。则样品液对DPPH自由基的清除率为

方法详见文献[11]。

2.7 Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中抗氧化活性（AOA）的测定

将储备液稀释成质量浓度分别为0.1、0.2和0.3 mg/mL的鼠曲草黄酮溶液和VC溶液为样品液。卵黄悬浊液用卵黄和等体积的pH=7.45、浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（PB）配成体积比1∶1的悬浊液，磁力搅拌10 min，再用PB稀释成体积比1∶25的悬液置于冰箱中备用。取0.2 mL体积比1∶25的卵黄悬浊液、0.2 mL的25.0 mmol/L FeSO4溶液和0.2 mL样品液于一系列10 mL离心管中，用PB补充至2.0 mL，37℃培养24 h，取出后加入0.5 mL质量分数20%的三氯乙酸溶液（TCA）摇匀，10 min后再加入1.0 mL质量分数0.8%的硫代巴比妥酸溶液（TBA），置于沸水浴15 min，冷却后以3 500 r/min的转速离心10 min，取上清液，在532 nm波长下测定吸光度值A；对照管除不加样品液外，其它试剂同前，所测吸光值为A0，平行测定3次，取平均值。空白管以2.0 mL PB代替，则样品溶液对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率为

方法详见文献[12]。

3 结果与讨论

3.1 鼠曲草黄酮微波提取条件的优化

按方法2.1进行提取，固定其他条件，分别测定在不同料液比、提取时间、提取温度和乙醇体积分数下的鼠曲草黄酮得率，结果如图1所示。

图1 料液比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of the ratio of material to liquid，time，temperature and ethanol concentration on flavones extraction

由图1可以看出，随着提取液比例的增大，黄酮提取量不断升高，当料液比达到1∶60时达到最高，之后黄酮得率有所下降。这是由于鼠曲草全株密被白绵毛的特点，随着提取液比例的增大，浸润程度增大，同时根据分散剂由高浓度向低浓度扩散原理，增大提取液比例也会增进黄酮的析出。但液料比过大的时候，会影响到物料对微波能的吸收，导致黄酮得率下降，故选择提取鼠曲草黄酮的料液比为1∶60。提取时间的延长促使黄酮提取量逐渐增加，在6 min处达到最大，之后保持稳定，因此选择6 min为鼠曲草黄酮提取的最优时间。在微波处理温度小于60℃时，随着温度的增加，总黄酮提取得率也随着增加，并在60℃时达到最大值；在微波处理温度大于60℃以后，过高的温度会使提取物部分分解或变性，同时杂质溶出量增加，提取率会明显减小[13-14]。故微波处理温度以60℃为宜。黄酮甙是由黄酮甙元与糖基构成，黄酮甙元极性较小，糖基极性较大，故黄酮甙是中等极性的物质。根据“相似相溶”原则，黄酮甙易溶于中等或中等偏上极性的溶剂中。乙醇体积分数超过50%时，极性相对偏低，黄酮甙的溶解度也降低。并且乙醇体积分数较高会使细胞蛋白质很快就凝固，不利于乙醇向细胞内渗透[15]。因此，本实验中选50%体积分数的乙醇作为提取溶剂。

3.2 总抗氧化活性

根据实验方法2.3，测定样品和VC不同质量浓度下的吸光度，得到其抗氧化活性强弱，结果见图2。

图2 样品液终质量浓度与吸光度的关系Fig.2 Relationship of final concentrations of samples and absorbance

由图2可以看出，样品的吸光度随质量浓度的增加而增加，说明质量浓度越大，其抗氧化性就越强。与抗氧化剂VC相比，两倍量的鼠曲草黄酮的总抗氧化能力约等于一倍量VC的总抗氧化能力。

3.3 清除羟自由基的能力

根据实验方法2.4，得到样品和VC在不同质量浓度下的吸光度，根据公式（1）计算对羟自由基的清除率，结果见图3。

图3 样品液终质量浓度与羟自由基清除率的关系Fig.3 Relationship between sample concentration and hydroxyl radical scavenging

从图3可以看出，样品液对羟自由基的清除率随质量浓度的升高而变大，同质量浓度下，鼠曲草黄酮对羟自由基的清除能力远远大于VC。

3.4 清除超氧阴离子自由基的能力

参照试验方法2.5.1，扫描邻苯三酚自氧化随时间变化的激发与发射光谱，结果见图4。

图4 邻苯三酚的激发光谱（左）和发射光谱（右）Fig.4 Excitation spectra （left） and emission spectra（right） of pyrogallol

实验表明，邻苯三酚自氧化产物的荧光强度随时间逐渐增大，从而得到荧光强度与时间的线性关系，直线的斜率为邻苯三酚自氧化速率V0。邻苯三酚自氧化产物的最佳激发波长和发射波长分别为444 nm和509 nm。

参照试验方法2.5.2进行测定，得出样品液对邻苯三酚自氧化产物的影响结果，见图5。

图5 黄酮（a）和Vc（b）荧光动力学曲线Fig.5 Curve of fluorescent kinetic of flavones（a） and Vc（b）

从图5可以看出，样品液的质量浓度越大则曲线斜率越小，表明样品液对邻苯三酚自氧化的抑制作用越强。按公式（2）计算得到样品液在不同质量浓度下对超氧自由基（O2-·）的抑制率，见表1。

表1 样液对超氧自由基（O2-·）的抑制率Table 1 Inhibitory rate of sample concentration on superoxidic radicals

实验表明，鼠曲草黄酮在低质量浓度时对超氧自由基（O2-·）的作用不明显，但当升高其质量浓度时，其抑制力明显增强。

3.5 对DPPH自由基的清除能力

根据方法2.6，按照公式 （3）计算样品液对DPPH自由基的清除率，结果见图6。

图6 样品液终质量浓度和DPPH自由基清除率的关系Fig.6 Relationship between sample concentration and DPPH radical scavenging

由图6可以看出，随着样液质量浓度的增大清除率也随之增大，当鼠曲草黄酮样液终质量浓度达到1.25×10-3mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到81.77%，略低于同质量浓度的VC。

3.6 对Fe2+诱发卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用

按照实验方法2.7，得到黄酮溶液和VC溶液在不同质量浓度下的吸光度，根据公式（4），计算出样品液对Fe2+诱发卵黄脂蛋白过氧化的抑制率，结果见图7。

图7 样品液终质量浓度对Fe2+诱发卵黄脂蛋白过氧化的抑制率的影响Fig.7 Inhibition effect of sample concentration on the peroxidation of yolk lipoprotein induced by Fe2+

由图7可以看出，随着样液质量浓度的增加，对于Fe2+诱发卵黄脂蛋白过氧化的抑制率逐渐增强，当黄酮溶液终质量浓度达到2.4×10-2mg/mL时清除率达到76.80%，高于同质量浓度的VC。

4 结语

通过实验得出微波功率固定为500 W时，微波提取的最佳工艺为:乙醇体积分数50%，料液比1∶60，温度60℃，时间6 min，在此条件下得到的最高黄酮得率为4.63%。鼠曲草黄酮在总抗氧化能力、清除超氧阴离子自由基的能力、清除DPPH自由基的能力略低于抗氧化剂VC，但在清除羟自由基的能力和抑制Fe2+诱发卵黄脂蛋白过氧化的能力上鼠曲草黄酮强于VC。结果表明，鼠曲草黄酮是一种很好的天然抗氧化剂，本实验结果为鼠曲草植物的开发利用提供了理论依据。

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