miRNA在运动免疫中的应用前景

苏利强

(江西中医药大学体育教学部，江西南昌330004)

随着科学技术的发展，生物学领域不断更新信息，自miRNA被发现到有深入研究，已经取得了很多成果。研究结果也显示了miRNA具有特定的生物学功能，在生命的发生、发展、细胞分化、细胞凋亡、免疫调节等过程中有重要的作用，但目前对其在运动免疫领域中的研究尚少，本文针对miRNA研究的热点问题并结合运动免疫学知识，阐释miRNA在运动免疫学中的研究前景。

1 miRNA的功能

RNA与DNA关系非常密切，并且功能繁多，RNA的微片断过短而无法构成基因，却可以和长得多的mRNA发生互补作用，影响DNA翻译成mRNA，从而影响蛋白质的合成，对细胞、机体产生作用。小RNA不翻译为蛋白质，属于非编码的RNA分子(noncodingRNA，ncRNA)，在真核细胞中很多功能都受ncRNA的控制，通过影响基因的表达，影响细胞周期以及个体的发育等多种生物学行为。目前，在小RNA的分类方面主要包括两类:微RNA(microRNA，miRNA)和小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，其长度一般为21—22个核苷酸，也有少数小于20个核苷酸的miRNA，其能够通过与靶mRNA特异性的碱基配结合来影响靶mRNA的降解或者抑制mRNA的翻译，通过这种方式可以对基因进行转录以及表达的调控。miRNA对基因的调控较为广泛，它可以通过多种形式对生物体的生长、发育、细胞分化、凋亡及应激反应等的各个层面进行调控。miRNA的靶基因一般为生物中发育基因，表明miRNA在控制生物发育的各个方面有重要作用。miRNA还可参与生命中生物活动过程的重要进程包括早期胚胎发育、细胞增殖、分化、细胞凋亡、细胞死亡，miRNA更重要的是可通过特殊途径调节干细胞的分化，对干细胞通过正常的G1/S检查点是必要的。miRNA可能使干细胞对外界信号不敏感而导致细胞周期停止在G1/S过渡期，这可能是对干细胞调控的一个重要机制之一。miRNA序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为mRNA编码蛋白质的调节因子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育产生重要影响。在基因组中miRNA的基因存在形式以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在，多数定位于基因间隔区，miRNA的转录往往独立于其他基因，并且不会翻译成蛋白质，它的生物学作用是调节其他基因的表达活性，在生物的生长发育中起着重要的调节作用，对基因组的功能研究、人类疾病防治、生物进化探索以及运动免疫学的发展均具有重要意义。

2 miRNA的表达调控机制

自1993年和2000年首次在线虫中发现lin-4和let-7(miRNA家族的两个最初成员)以来，科学家先后通过各种生物学方法，如分子克隆、生物信息等对生物体中的miRNAs进行鉴定。目前，已鉴定出5 000多种miRNAs，并且miRNAs库还在不断更新。在miRBase(release 10)所登记的miRNAs数据库中，人类含有533种miRNAs，小鼠含有442种miRNAs，在生物体内miRNAs基因是由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)或RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)转录而生成含有茎环结构的初级miRNAs(primary miRNAs，Pri-miRNAs)。Pri-miRNAs随后分别由 Drosha和 Dicer切割加工成大约22nt的miRNA双链体(duplex)。人类双链体中的功能链进入miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complex，miRISC)中，通过碱基对相互作用指导复合物识别靶标分子的3端非翻译区(3 untranslated regions，3’UTRs)，对靶mRNAs进行调控，miRNAs的调控方面，可以通过两种方式对靶分子进行调节，一是可以直接对靶mRNA的碱基见得酯键进行破坏，从而降解靶mRNA，另一方式是可以通过与某种靶mRNA序列的结合来抑制靶mRNA的翻译，从而实现对其调控。也有实验证明miRNAs也可能通过抑制5’UTR含有内部核糖体进入位点(internalribosome entry sites，IRESs)的靶标分子。最近，在果蝇中发现存在一种miRNAs的亚族mirtrons，它们的二级结构缺少典型Drosha加工pri-miRNAs的低茎(1ower stem)结构，它们是由剪接复合物和套索分支酶(1ariat-debranching enzyme)完成加工生成pre-miRNAs结构，然后进入典型的miRNAs加工过程并行使miRNAs的功能。而在典型内含子miRNA(intronic miRNAs)基因的加工过程中，Drosha切割pri-miRNAs发生于宿主基因内含子剪接之前。miRNAs已成为基因表达调控的重要因子。miRNAs通过使其靶mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达。每个miRNA都有数百个进化上保守的靶基因，以及几倍的非保守的靶基因。目前估计人类O3的基因可能被miRNAs调控。

miRNAs在生命活动过程中以崭新的层面调控着基因表达过程，在生长、发育、免疫机能调节、心脏功能、细胞增殖及分化、细胞凋亡等生命活动过程发挥着重要的作用。由于运动过程对机体的免疫机能也有重要影响，然而运动对免疫机能影响的层面较为广泛，单一方面的指标较难全面反映机体免疫状况，鉴于miRNAs对机体免疫机能的强大调控能力，其将会在运动导致免疫机能的评定方面有重要前景。

3 miR-146对免疫功能的影响

在哺乳动物的免疫反应中，miRNA与免疫反应有紧密的关联，miRNA在免疫细胞对抗微生物的感染过程中起着重要作用。单核细胞经LPS刺激后，miR-146，miR-132和 miR-155表达明显增高，造成这一现象的原因是首先TLR识别细胞表面的病原体相关模式分子(PAMP)，然后激活下游的信号分子，从而诱导miRNA表达的增加，有些miRNA对固有免疫起到了直接的作用，可作为负性调控因子激活TLR信号途径。从同源性角度分析，TLR与IL-1受体(IL-1 receptor，IL-1R)及TNFR具有较高的同源性，TLR和IL-1R、TNFR与其相应的配体结合后可激活相似的信号转导通路。因此，认为这些炎症细胞因子IL-1、TNF等，也能诱导miR-146的表达，在程度上有轻重不同。有学者提出，TLR信号转导通路的重要抑制分子是miR-146。LPS或细菌成分激活TLR4及下游的NF-κB途径，诱导表达免疫相关基因，包括miR-146。为了了解miR-146与TLR的关系，研究人员分析了成熟miR-146与其靶基因IRAK1和TRAF6 mRNA的关系，结果发现miR-146可以抑制IRAK1和TRAF6的蛋白表达，从而影响下游的基因表达，这一结果显示了miR-146对TLR介导的自然免疫反应起负反馈调节作用。在哺乳动物中miR-146的成熟体可以分为两个亚型，分别为:miR146a和miR146b。miR146a和miR146b的基因分别定位于不同的染色体上，但却具有较高度同源性，仅在3’UTR末端的部分序列有所不同。在分析miR-146的两个亚型表达中发现:LPS诱导后两个亚型表达趋势不同，miR-146a表达增加，miR-146b表达却基本不变，显示了miRNA家族的调控模式不如想象中复杂。随着对miR146a和miR146b研究的深入，发现miR-146a/b由细胞膜表面识别细菌组分的TLRs(TLR2，TLR4，TLR5)配体诱导。通过研究发现TNF-α和IL-1β刺激后均能使miR-146的表达增加，miR-146发挥作用的直接靶因子是TRAF6和IRAK1，显示miR-146a/b可以作为负调控分子，依靠互补结合于IRAK1或TRAF6的3’UTR区域在转录后水平抑制TRAF6和IRAK1的表达，从而实现对免疫信号转导起到反馈调节作用。

从上面研究结果可以看出，miR146a和miR146b对免疫机能有较大影响，与运动免疫有密切关联的 TNF-α 、IL-1、IL-1β、NF-κB 均受 miR146的调控。运动过程中由于各种因素导致IL-1、IL-1R、TNFR、NF-κB的变化可能与 miR-146有密切关系，由于miR-146的调控方式特殊，调控范围广，所以miR-146将会对运动导致免疫机能的变化起重要作用。因此，miR146对运动免疫的研究具有较高价值。

4 miR-181对免疫功能的影响

研究人员从小鼠骨髓细胞中克隆了约100个miRNA，对其进行逐一系统分析，结果发现小鼠的造血器官中有三个miRNA的表达存在显著差异，miR-181a是其中重要的一个，以上研究也显示了miR-181a与造血器官的功能存在一定的联系。由于运动可以造成造血器官的功能发生一定变化，因此miR-181a对运动导致的免疫机能变化可能存在内在联系。通过对T淋巴细胞对抗原的敏感性实验发现，miR-181a的表达水平与T淋巴细胞对抗原的敏感性相一致，显示了miR-181a在淋巴细胞发育过程中的阳性选择和阴性选择中起着重要作用，miR-181a的靶分子是各种磷酸酶，如 SHP2、PTPN22、DUSP5以及DUSP6，所以miR-181a能影响TCR的信号。Neilson等克隆了T淋巴细胞发育过程中的个阶段的小 RNA 序列，包括 DN1、DN3、DN4、DP、CD4和CD8 T淋巴细胞，发现与DN或成熟的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞相比，在CD4+CD8+DP阶段miR-181a高表达。

在成熟的T细胞中，miR-181a表达的增加可以提高T细胞对肽抗原的敏感性，当抑制了miR-181a时T细胞的敏感性下降，损害阳性选择和阴性选择。这种效果是miR-181a可以部分下调多种磷酸酶，导致提高了磷酸化中间产物的平衡以及降低TCR信号阈值。因此，高表达的miR-181a与成熟T细胞的敏感性有关联，认为miR-181a在T细胞发育成熟过程中对内源性抗原的信号传递起到重要的调控作用。这些实验结果无疑显示了miR-181a对TCR的信号转导和调控T淋巴细胞对抗原的敏感性有着重要作用，而这些内容对运动导致的免疫机能变化也密不可分，miR-181a在运动免疫抑制的研究中将有广阔前景。淋巴细胞在运动免疫领域中的研究已经取得了一定的成绩，目前发现miR-181a对免疫细胞分化和免疫器官发育中都有重要作用，运动对细胞亚群和免疫器官都有重要的影响。目前我们实验小组做出的结果显示超负荷的四周游泳运动对大鼠外周血淋巴细胞miR-181a的表达有一定影响，并且同时观察了IL-4和IFN-γ，结果发现 miR-181a的表达变化可能与运动导致的免疫失衡有关(该成果待发)。我们对miR-181a的研究，将会对运动导致的免疫变化机制起到重要的补充作用。

5 miR-155对免疫功能的影响

miR-155位于进化保守的非编码RNA bic基因外显子二区。为了解miR-155的作用，采用转基因技术将小鼠体内的miR-155基因敲除，给予miR-155敲除小鼠减毒沙门氏菌疫苗免疫，结果显示敲除了miR-155基因的小鼠不能出现沙门氏菌疫苗抗原性，因此miR-155在适应性免疫应答过程中是不可缺少的重要环节。在研究miR-155对淋巴细胞的影响中，通过对敲除miR-155的小鼠进行研究，发现敲除miR-155的小鼠淋巴结生发中心内成熟B细胞生成明显下降，再给予一定抗原刺激后发现血液中的IgM水平显著降低，IL-2和IFN-γ的表达也出现下降趋势，因此，miR-155在B细胞和T细胞免疫应答过程中起着重要作用;将淋巴细胞体外培养实验证实miR-155能够影响Thl、Th2的功能，对T细胞活化后分泌的细胞因子具有一定的调节功能。将小鼠miR-155敲除，研究miR-155在T细胞抗原呈递过程中的作用，发现敲除miR-155的小鼠不能使树突状细胞和T细胞发生相互作用，树突状细胞无法向T淋巴细胞有效呈递抗原，miR-155敲除的小鼠与正常小鼠相比抗细菌感染能力差，抗体滴度低，T细胞反应水平也低，肺组织也会出现疤痕，这些症状与人类自身免疫病症状相类似。通过进一步的研究发现，miR-155会导致150多个基因活性下降，其中包括对T细胞功能非常重要的基因c-Maf。有研究采用用TLR4配体和LPS刺激单核细胞系，miR-146a、miR-155和miR-132表达上调。miR-155可被TLR3配体 poly(I:C)和 IFN-β/γ共同诱导表达。miR-155的表达还可以由 IFN-β，IFN-γ 通过 TNF-α自分泌或旁分泌来诱导。miR-155既是细菌引起的免疫应答的炎症调节子，也是病毒引起的免疫应答的炎症调节子，广泛参与固有免疫应答。有研究证实，巨噬细胞受LPS刺激诱导产生miR-155，LPS信号通路中的蛋白，如FADD、IKKε和Ripkl等是miR-155的靶分子，说明和 miR-146一样，miR-155对LPS介导的免疫应答起负性调节作用。

以上结果证明了miR-155在免疫系统中的作用。通过基因敲除技术证明了miR-155与免疫过程的发生发展有密切关联，包括运动免疫领域中的热门问题。如运动会导致IgM、IL-2和IFN-γ水平变化，也涉及了运动对Thl、Th2细胞亚群的影响，以及运动对抗原呈递信号的影响，与运动性免疫抑制发生发展过程中的T细胞活化、分化，以及细胞因子的表达变化均有密切关系，因此，miR-155对运动性免疫抑制的发生可能有内在联系。所以，miR-155与运动免疫领域中的热点问题密切相关。

6 其他miRNA对免疫机能的影响

miR-142定位于l7号染色体中一个和侵袭性B淋巴细胞白血病相关的位点。在小鼠骨髓细胞中，红系和T淋巴细胞系低表达miR-142，B淋巴细胞系和髓系细胞高表达miR-142。给小鼠骨髓来源的造血祖细胞转染miR-142，把细胞种在骨髓基质细胞上，同时给予细胞因子和生长因子，miR-142对B淋巴细胞没有大的影响，但是却使T淋巴细胞增加了30%～40%。

miR-150在成熟的淋巴细胞中表达，而在其前体中没有表达。通过预测，c-Myb是miR-150靶基因比较靠前的一个，c-Myb转录因子控制着淋巴细胞发现的多条途径。通过loss-and gain-of-function基因定位方法研究miR-150，结合有条件的与局部剪切c-Myb，结果发现是在一定剂量依赖的范围内，miR-150控制着c-Myb的表达，这种关系影响了淋巴细胞的发展和反应，在淋巴细胞中鉴定了一个主要转录因子作为miRNA阶段性特异表达的关键性靶因子。

探讨miR-122的表达和由D-GalN/LPS诱导小鼠急性肝功能衰竭的进展和发展的关系中发现，miR-122 与 ALT 呈负相关(r=-0.505)，与 TNF α 和IL-6 呈现正相关(r分别为:0.493，0.674)。

哺乳动物的造血细胞与免疫功能密切相关，有学者对人和小鼠的造血细胞进行了研究，通过分析得到结果:在不同的造血细胞中miRNA的表达量有所不同，并且还发现与非造血细胞比较，造血细胞中也有不同的miRNA表达。通过这些结果可以推断miRNA在哺乳动物的造血细胞中起重要作用。通过对不同发育过程的造血干细胞中miRNA表达的分析，结果发现不同阶段有不同的miRNA表达，这也证明了在造血细胞分化阶段miRNA可能起到了重要作用。

从以上内容可以看出，miRNA种类多，对免疫机能的调控有较大作用，从基因转录到翻译成蛋白都可能有miRNA在调控。运动过程中机体免疫机能的变化也是从基因到蛋白过程中逐一调控下实现的，目前运动免疫学研究中没有一个很好的指标来客观地反映免疫机能，只能反映某一部分的功能，因此，miRNA可以作用于一组mRNA，这种强大功能可以为研究运动免疫学的发展提供思路，在研究运动过程中，miRNA对免疫机能的调控有较为广阔的前景。

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