尿液蛋白质组学分析技术在运动训练中的应用

范锦勤，阮定国

蛋白质组(Proteome)是指在一定条件下，由一个特定细胞或生物体产生的所有蛋白质，是依据其组分的序列、结构、丰度、定位、修饰、相互作用和生化功能来确定的［1］。蛋白质组学的主要任务是识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，并分析蛋白质的功能及其模式［1］，可以同时对标本中所有表达蛋白质的动态变化进行分析研究。尿液包含了人体内每一个细胞的代谢信息［2］，从中能找到90% ～97%的血浆蛋白［3，4］。在一般情况下，正常人尿中的蛋白质含量很少，常在10mg%以下(低于150mg/24hr尿)［5］。当激烈运动或病理状态下，尿液中的蛋白质会增加或出现一些特殊的标志物。由于尿液标本的获取方便、没有侵入性，使尿液蛋白质组学研究逐渐成为关注的焦点。

1 运动性蛋白尿

1．1 运动性蛋白尿的概念

在激烈运动下，尿液中的蛋白质会增加。这种由于运动使尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿［5］。运动性蛋白尿常含有血浆蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、酶等，且运动员不伴有其他症状(如血尿、腰肾区疼痛、全身无力等)，在运动结束八小后时尿蛋白即呈阴性。

1．2 运动性蛋白尿产生的机制

一般认为，运动性蛋白尿产生的原因是:运动时肾上腺素、去甲肾上腺素、肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶分泌增加，使肾血管收缩，肾血流量减少，肾小球毛细血管压上升，滤过分数增加。肾小球膜电性和可滤过蛋白的电荷变化，使肾小球滤过较大分子量的蛋白质较多。但运动时肾小管的重吸收处于饱和状态，同时还会增加某些小分子量蛋白质的分泌，如 β2-微球蛋白(β2-MG)、溶菌酶(Lys)等，从而引起运动性蛋白尿［5］。周涛等［6］认为力竭运动诱发肾脏组织自由基作用的加强和自由基清除能力的相对不足，会导致运动性尿蛋白排泄率升高。

1．3 影响运动性尿蛋白的因素

影响运动后尿蛋白排出量的因素有很多，如运动量、运动强度、运动项目、运动者训练水平、年龄、运动环境、个体遗传差异和情绪等。徐晓阳等［7］在对游泳运动员比赛时尿蛋白变化的研究中认为:运动员主观感觉好，成绩好时，尿蛋白排出量较低。正常情况下，运动员个体每天的尿量及其成分都能维持在一定的水平;运动员在运动过程中，如果血液成分发生改变，肾小球的通透性增加，或肾小管的重吸收作用减弱，或肾小管和集合管的排泄与分泌功能失常，都会直接影响到尿量或尿蛋白组份的改变。此外，运动作为一种应激原，也可直接影响到尿量和尿蛋白组份的改变。在众多的影响因素中，以运动强度的影响最大。一般来说，运动强度越大，尿蛋白的排泄量就越多。

2 运用尿蛋白监控运动训练的探讨

2．1 运用尿蛋白监控运动训练的现状

测定运动后尿蛋白质的种类和含量，是用于评定运动强度及运动员机能状态的重要指标之一。我国在这方面的研究工作始于上世纪六十年代［8］。王健等［9］观察到大强度跑台运动后，尿白蛋白(ALB)、β2-MG和Lys排泄均显著增加。同时，王健等［10］认为Lys排泄是评价大强度跑台运动既灵敏又可靠的生化指标;冯美云等［11］认为尿β2-MG排泄量可能是评价体院男子足球运动员身体机能和承受运动强度的灵敏指标;徐晓阳等［12］认为尿ALB是评定竞走运动员身体机能状态的灵敏指标。这些研究结果的差异可能与研究对象、运动形式的不同有关，提示对不同运动方式的运动员进行机能状况评估时，其判定的标准是不同的;许实德等［13］也认为用尿蛋白评定负荷量强度时，宜进行自身或同批受试者相同运动项目的比较，否则没有评价意义。

在现有研究中，对于运用运动后尿蛋白指标，评定运动强度和运动者机能状态的主要结论有:(1)运动强度是影响运动后尿蛋白数量和排泄量的主要因素［14］;(2)不同的负荷强度对蛋白种类有一定的影响，可用尿蛋白的白/球比值评定负荷强度［15］;(3)运动后尿蛋白少，表明机能状态较好［7］;(4)运动后尿蛋白消除快，表明运动员恢复状态较好［9，16］;(5)在一次大运动量训练后，尿蛋白排出量增多，四小时后或次日凌晨完全恢复到安静时水平，表明机体适应此负荷。如果次日凌晨尿蛋白不减少或增加，要适当减少运动量和强度;(6)在一个训练周期中，当运动负荷安排适宜时，运动员可表现为尿蛋白排泄量先增多而后逐渐减少。如尿蛋白排泄量在整个训练周期中始终处于较高水平，甚至继续增加，则说明运动员对运动负荷始终没有适应，或是运动员身体机能水平下降，应酌量减少运动强度或运动量。

尿液中的蛋白质成份复杂。2002年，Thongboonkerd等［17］分别用“丙酮沉淀”和“超速离心”法分离正常成人尿液蛋白成分，并采用双向凝胶电泳(2-DE)方法进行分析，鉴定出47种蛋白分子;2004年，Oh等［18］对透析、冻干后的尿样使用凝胶过滤除去尿液白蛋白等高丰度蛋白的干扰，再进行2-DE，最终通过电离飞行时间质谱(MALDI-T0FMS)自凝胶上的点鉴定出113种不同的蛋白;随着检测技术的进步，2006年，Adachi等［19］在健康者尿液中，测出近1 500种蛋白质及其片段。而现有运动后尿蛋白研究多局限在尿 ALB、β2-MG、Lys酶等几个指标上，这是受传统的蛋白质分离与鉴定技术所限，难以对蛋白质组进行高通量、快速地并行研究。有学者提出［20］，尿液蛋白质组学是诠释蛋白所携带信息的最有效方法。

2．2 尿液蛋白质组分检测在医学中的应用

尿液蛋白质组学研究是近几年发展起来的研究方法，目前已应用于糖尿病、肿瘤、肾脏疾患等诊断和疗效观察中。如丁娟娟等［21］分析了激素耐药型原发性肾病综合征(SRNS)、儿童与激素敏感型原发性肾病综合征(SSNS)、儿童尿液全蛋白2－DE图谱的差异蛋白质位点，筛选出SRNS组与SSNS组(治疗前)尿液2-DE凝胶差异蛋白质点66个。SRNS组与SSNS组(治疗后)尿液2-DE凝胶差异蛋白质点33个，为进一步运用蛋白质组学技术寻找与特发性肾病综合征激素耐药或激素敏感相关的蛋白质打下了基础;吴登龙等［22］用IMAC-Cu-3芯片结合表面加强激光解析电离化飞行时间-质谱(SELDI-TOF-MS)技术对40例肾癌患者及40例正常对照，40例非肾癌其他泌尿系统疾病对照患者的尿液进行研究，发现肾癌差异明显的潜在标记物有四个;贾雄飞等［23］利用2-DE和生物信息学技术，从严格筛选的两例急性肾移植排斥反应(AR)患者尿液标本中，发现了三个含量变化趋势与排斥反应密切相关的蛋白，分别是α-1抗胰凝乳蛋白酶(AACT)、肿瘤排斥抗原gp96和锌-α2糖蛋白。

2．3 尿液蛋白质组学检测技术在运动训练中应用的可行性

尿液蛋白质组学的研究方法和实验技术也有可能应用于运动后尿蛋白组分的研究中。李江华等［24］通过代谢组学的方法发现，参加多哈亚运会短距离游泳比赛的决赛运动员们的尿液中，甲基尼克酰胺的相对含量明显高于非决赛运动员(P＜0．01)，认为运动员尿液中包含了与运动员竞技水平相关的信息。运动会引起人体的生理环境，机体中离子的浓度和种类、pH值、营养状态、代谢产物堆积、激素浓度等因素发生变化，对基因表达和蛋白质合成后的修饰加工产生影响，蛋白质组图谱与正常生理状况下的蛋白质组图谱会出现差异，且不同的个体对上述因素的影响应答不同，蛋白质组图谱也会有所不同。

尿液标本取材方便无创伤性，蕴含着大量的能量代谢和物质代谢信息，且先前的研究对我们认识运动与单个蛋白质的关系具有一定的启发。蛋白质组研究技术具有高通量和高效、准确、灵敏的特点，可从整体角度研究运动与尿液蛋白质组分之间的关系。

3 尿蛋白组学研究在运动训练中的应用展望

3．1 揭示运动训练对机能影响的本质和规律

运动后机体尿蛋白表达图像斑点可能会上调、下调、出现或消失，其蛋白质组分的种类和含量可能会发生改变。通过对尿液的蛋白质组学研究，可以描绘出不同方式、不同强度运动及不同身体机能状态下的蛋白质表达图谱，以揭示运动训练对机体机能影响的化学本质和不同运动员差别的内在规律，并可从中寻找和总结优秀运动员的尿液特征蛋白质图谱，指导运动员选材。李江华等［25］采用Fisher逐步判别分析法，初步证明了利用代谢组学模型预测高水平男子中短距离游泳比赛成绩的可行性。

3．2 监控运动训练强度，提高运动成绩

不同的运动项目引起机体尿液蛋白质组分的改变可能存在着较大的区别，而功能关联的蛋白质在表达水平上也应存在着一定的相关性。通过研究不同运动项目的尿蛋白组分，从中找出特征性的蛋白质作为训练监控的新指标及运动性过度疲劳早期诊断的标志物，进而利用尿液中的标志蛋白检测来了解运动员的负荷强度、训练水平、训练中疲劳程度，预测运动员成绩，科学评定运动员在大运动量训练期间的身体机能和运动负荷，并可在专项运动项目中有的放矢。通过训练、营养学等因素干预蛋白质的含量、结构和功能，能够最大限度地发掘人类的运动潜力，提高运动成绩。

3．3 开发新的运动营养补剂

合理营养是机体维持正常生长发育和健康的重要保障，这对青少年运动员及在大负荷训练期间的运动员尤为重要。Kohler等［26］比较了马拉松比赛后、耐力运动员休息期间和健康成年人的尿液蛋白质组学图谱，发现马拉松比赛后，运动员尿液中血红素结合蛋白、白蛋白、血清类粘蛋白-1，转铁蛋白和碳酸酐酶-1显著提高，而在休息期间，运动员的尿液蛋白质组图谱和健康人无明显差别。可利用尿液蛋白质组分的研究成果，抑制容易引起运动性疲劳发生的蛋白(或酶)合成，促进具有消除运动性疲劳功能的蛋白(或酶)合成，开发更为有效的运动营养补剂配方。可根据不同个体的情况，设计适合于不同运动项目、不同运动个体的营养补剂，从分子水平上为高水平运动员设计个性化营养方案，进而达到提高运动能力的目的。

3．4 研发不同功能的蛋白质芯片

利用尿液蛋白质组分的研究成果，可以制作成不同功能的蛋白质芯片，以使各种实验操作更为简便。如在尿液蛋白质组分中筛选出运动性疲劳的标志物(酶类或多肽)，然后制作成受体芯片或酶芯片。将采集的运动员尿液样品进行标记后与这种芯片反应，即可在同一时间内对疲劳标志物进行高通量的并行检测，用于判断运动员疲劳或恢复的程度，及时调控训练计划，也可根据兴奋剂引起尿蛋白组分的排泄特点研发兴奋剂检测芯片。如杜冠华等［27］将蛋白质芯片技术与受体配基竞争原理结合，用天然的受体直接检测兴奋剂，取得了较好进展。蛋白质芯片不仅可对药物兴奋剂进行检测，即使是“基因兴奋剂”也难逃其“慧眼”［28］。

3．5 制定运动处方，指导科学锻炼

糖尿病、肥胖、高血压、高血脂、冠心病等又称为生活方式疾病。近年来有上升的趋势，药物、饮食和运动是治疗这些疾病的“三驾马车”。而运动对于机体的干预则因人而异，利用蛋白质组学技术，检测患者尿蛋白质组分的变化，了解运动对个体蛋白质种类和量的影响，为建立科学的个人运动处方提供理论依据［29］，及时监控健身者机能状态和调整健身运动计划，指导科学锻炼，提高大众健康水平。

3．6 存在的难题

然而通过中国期刊网和Medline数据库查阅文献发现，有关尿蛋白组份在运动训练中的应用及指标开发研究很少;从运动训练的负荷评定实践中也发现，尿蛋白成份的检测很少被科研人员使用。笔者认为，造成这种现状的原因有两点:一是已研究发现的尿蛋白组份指标用来评定运动负荷及身体机能的特异性不强，还需寻找更敏感的尿蛋白组份评价指标;二是可能与尿液的采样时间、采集方式及尿蛋白组份测试过程中的标准化程度不高，或影响测试指标的因素太多而引起测试结果变异太大有关。林文弢等［30］也指出，尿液蛋白质组学研究在体育科学中的应用还需限定制定一个可行性的标准化的测试方法。由于蛋白质组学技术与方法的难度较高，目前在运动人体科学领域研究中的应用仍为少见。但尿液生化指标采样方便、无损伤，可重复取材，不影响正常训练的进行，比血液生化指标能更敏感地反映机体产生应激的程度［31］。我们相信随着蛋白质组学技术的不断完善和发展，尿液蛋白质组学研究在运动训练中的应用具有广阔的前景。

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