硫酸软骨素含量测定方法的研究进展*

张　莉

(天津市药品检验所，天津　300070)

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种天然酸性黏多糖，属生物高分子化合物。CS有A、C和D三种异构体，以A和C异构体居多，其均由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3-糖苷键结合的双糖为基本单位聚合而成。只是硫酸基团的位置不同，前者为4位，后者为6位。目前CS主要是从猪、牛或鲨鱼等动物的喉骨和鼻中骨等软骨中提取，其相对分子质量10 000～50 000。CS用途广泛，主要用在治疗神经性头疼、偏头痛、骨关节疾病、冠心病和心绞痛，对链霉素引起的听觉障碍具有显著的临床效果。近年来有关硫酸软骨素与氨基葡聚糖、玻璃酸钠等药物联合使用[1，2]治疗骨性关节炎的报道越来越多，制成复方制剂后其抗炎、镇痛效果更加显著。随着对CS生理功能及其理化性质的进一步深入研究，在医药制剂、日用产品、医药材料、保健品等领域，CS的用途将更加广泛，越来越引起人们的重视[3]。

1　我国现行的法定测定方法的应用情况[4，5]

现执行的质量标准[4，5]中硫酸软骨素含量测定方法主要分为三类，即Elson-Morgan比色法、咔唑比色法和酶解-高效液相色谱法。

1.1测定氨基己糖的Elson-Morgan比色法早在1989年，CS的质量标准即收载于《卫生部药品》标准生化药品第一分册。后此标准又收入于1998年颁布的《卫生部药品标准》二部第六分册。该法的测定原理是先将CS酸水解成氨基葡糖，然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛进行衍生显红色，在525 nm波长处测定吸收度,以盐酸氨基葡糖作对照品,计算氨基葡糖含量,进而换算成CS的含量。因此方法使用的对照品和酸水解后的产物有所不同，故不能真实的反映其主体结构的真实含量，准确度较低，结果重现性不好。

1.2测定葡萄糖醛酸的咔唑比色法该法收载于《国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》(第九册)，用于测定多种CS制剂。该法的测定原理是利用硫酸软骨素中的D-葡糖醛酸在饱和硼酸溶液和四硼酸钠硫酸溶液的共同作用下加热生成糠醛，在0.2%咔唑无水乙醇溶液中进一步加热显红色，显色后的溶液在520 nm 波长处有最大吸收,测定时以葡糖醛酸为对照品。该法因需要水解和显色，实验过程较为烦琐、复杂，而且干扰因素较多。操作过程中使用硫酸，也给操作者带来诸多不便。虽然准确度有所提高，但专属性仍然不是很好。

1.3酶解-高效液相色谱法2010年版的《中国药典》[6]采用了酶解-高效液相色谱法，用于测定 CS钠原料、片剂和胶囊剂。采用强阴离子交换硅胶为填充剂的色谱柱，分别以水(pH 3.5)和2 mol/L氯化钠溶液(pH 3.5) 为流动相，进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为232 nm。用CS钠对照品作为对照，按外标法以硫酸软骨素A、B和C的峰面积之和计算含量。反应的原理为CS 钠在硫酸软骨素 ABC 酶作用下，将硫酸软骨素钠酶解为硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和少量硫酸软骨素B三者的二糖单元。可准确判断产品软骨的来源，精确地反映CS 钠的真实含量，专属性强。

2　CS定量分析方法

CS定量分析方法有许多种，每种含量测定方法均有其特点，但测定原理均是根据其组成的糖单位(D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖)、硫酸基以及酸性黏多糖的大分子性质。

2.1光谱法

2.1.1分光光度法

2.1.1.1氨基己糖的测定 测定CS含量常用为Elson-Morgan反应法，该方法不仅操作烦琐,而且重现性差。

2.1.1.2已糖醛酸的测定 常用的方法为咔唑法，测定原理同前所述。万秀玉等[7，8]建立咔唑法同时测定玻璃酸钠和CS的含量。采用醋酸钠调节样品的酸碱度和离子强度，氯化十六烷基吡啶可选择性使CS沉淀，而玻璃酸钠不沉淀，从而将玻璃酸钠和CS进行分离。样品预处理条件为：精密量取玻璃酸钠和CS的混合溶液10 ml，加入醋酸钠1.6 g，12.5 mmoL/L氯化十六烷基吡啶10 ml，充分搅拌后，静置1 h，20 μm滤膜过滤；滤液用于测定玻璃酸钠的含量；滤饼经1.4 mol/L氯化钠溶液超声解离后，用于测定CS的含量，玻璃酸钠和硫酸软骨素的平均回收率分别为101.2%和99.4%，RSD分别为1.05%和0.96%。说明本法可同时测定玻璃酸钠和硫酸软骨素的含量，相互之间无干扰。该法较测定氨基葡糖法简单，由于操作过程中同样使用浓硫酸，给操作者带来诸多不便。

2.1.1.3阳离子染料法CS在水溶液中解离带负电荷，研究者利用这一特性分别采用一种阳离子染料吖啶橙，其在酸性条件下带正电荷；和醌亚胺类染料中性红，其本身也带正电荷，两种物质与CS的相互作用均能形成复合物，根据其复合物溶液在特定波长处随着吸光度降低与CS的含量成比例关系的特点，建立了一种快速、简便、灵敏的测定CS含量的光度法。

李明明等[9]建立了分光光度法测定CS含量。在pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，结晶紫在583 nm处有一特征吸收峰，结晶紫是一种阳离子染料，在酸性条件下带正电荷，结晶紫结构中的氨基带正电荷，CS的磺酸基和羧基带负电荷，两者通过静电引力和疏水作用力形成缔合物，产生变色效应，吸光度降低两者的吸光度差值与CS浓度在0.01～2.7 g/ml 范围内线性关系良好，平均回收率为99.7%。据此建立了一种检测浓度范围较大、灵敏度高、快速简便的分光光度法测定CS含量。

2.1.1.4间苯三酚分光光度法利用CS与含有间苯三酚的无机酸在100℃反应30 min，生成的有色物质在波长558 nm处有最大吸收，通过比色测定CS的含量，该方法将水解和显色反应一步完成，具有较好重现性，操作简单。尤其适用于生产企业准确快速检测CS的要求，是分光光度法测定CS比较理想的方法。

2.1.1.5荧光分光光度法逯家辉等[10]根据在pH 5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，结晶紫在232.0 nm光的激发下，于467.0 nm处有一个荧光峰，结晶紫分子的氨基在酸性条件下带正电荷，CS的磺酸基和羧基带负电荷，二者通过静电引力和疏水作用力形成缔合物，缔合物在467.0 nm处荧光强度增强，且荧光强度差值与CS浓度在0.002～1.7 μg/ml范围内呈线性关系，建立了一种快速、简便、准确的测定CS含量的新方法。并同时采用维多利亚蓝B分光光度法进行了比较，所测的结果基本一致，用于CS类药物的质量检测。

2.1.2化学发光方法李艳平等[11]建立快速测定CS注射液的化学发光方法。方法采用Ce4+-Na2SO3-H2SO4氧化还原体系，并利用体系中加入CS后发光强度增强的原理，建立测定CS的化学发光分析方法，并与间苯三酚分光光度法进行了比较。该方法不需要分光光度法中加热等步骤，所建方法快捷、简便、灵敏度高，可用于CS注射液中CS含量的测定，若能选择适当的萃取方法从生物样品提取CS，则可利用本方法进行体内药物分析。

2.1.3共振瑞利散射光谱法李继桃等[12]将CS与结晶紫相互作用生成复合物，该复合物分别在505和661 nm波长处有最大共振瑞利散射峰，分别用两种波长测定了CS注射液中CS的含量。

2.2光度滴定法利用CS可以与氯化十六烷基吡啶结合在适宜的条件下形成稳定的混悬液的性质, 徐志洲等[13]研究建立了在420 nm波长处用光度电极指示终点,快速测定CS含量的新方法。该方法可以防止生产厂家非法添加氨基己糖来提高CS含量的问题，是一种简而易行测定CS的检测手段。

2.3高效液相色谱法林燕飞等[14]建立以蒸发光散射为检测器，采用高效液相色谱法测定复方氨基葡萄糖片中CS。本方法能避免盐酸氨基葡萄糖对CS测定的干扰,分离度大于2.0，在流动相中加入0.1%的三乙胺，不仅促进CS的电离平衡, 而且使CS峰形严重拖尾的问题得以改善，该方法准确、快速、重复性好。

潘自国等[15]建立了RP-HPLC法同时测定CS总含量及其A、B、C、D 4个组分含量。采用C18柱，流动相为乙腈-0.5%磷酸-异丙醇 (15∶85∶1)，检测波长209 nm，柱温40 ℃。CS总量在0.4～2 mg/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.9997)，方法平均回收率99.3%，RSD为1.16%。

狄平平等[16]建立复方氨基葡萄糖片中盐酸氨基葡萄糖和CS含量HPLC测定方法。方法均采用C18色谱柱，盐酸氨基葡萄糖以0.68% 醋酸缓冲溶液-甲醇(82∶18)为流动相，检测波长为340 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl。CS以0.005 mol/L辛烷磺酸钠水溶液-乙腈(95∶5)为流动相，检测波长为195 nm；流速为0.5 ml/min；进样量为10 μl。结果盐酸氨基葡萄糖浓度在0.5061～4.100 mg/ml范围内与异构体峰面积线性关系良好，平均回收率为100.59%，RSD为1.21%(n=6)。CS的进样浓度在170.7～1001.5 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为99.87%，RSD为1.05%(n=6)。该方法简便、准确，可用于本品的质量控制。

石瑞平等[17]采用离子对反相高效液相色谱法测定CS含量及有关物质。该方法的检测波长为195 nm，已接近远紫外区，甲醇和乙腈的截止波长分别为205和190 nm，故流动相选用乙腈。同时流动相中加入了0.004 mol/L辛烷对氨基苯磺酸钠溶液。选用低浓度的离子对试剂使得CS的的分离效果更好而且基线稳定，干扰少，主成分峰拖尾现象也得到了明显改进； 该法准确、简便，重复性好，可作为控制CS滴眼液质量的方法。

David等[18]利用软骨素酶ACⅡ将CS酶解后，也采用离子对的液相色谱法对CS的含量进行了测定，该方法在240 nm波长处进行梯度洗脱，结果精确度高，重现性好，专属性强。

2.4电泳法电泳法样品制备简单、用量小，分析时间短，可应用于CS的定量分析。电泳测定方法包括醋酸纤维素薄膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和琼脂糖凝胶电泳法等

沈建如等[19]建立了高效毛细管电泳可以快速、准确地直接测定原料药及片剂中CS含量的方法。方法采用区带毛细管电泳为分离模式，操作电压30 kV，毛细管温度25 ℃，检测波长200 nm，操作缓冲液为15 mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH至3.0)，压力进样(50 mbar×15 s)，外标法定量。所用辅料对CS片剂的定量分析无干扰，CS的出峰时间在6.5 min左右，实验中电流噪音较小，分离效果良好。应用范围较广。可以满足实际生产中的检验需要。

3　展望

CS是重要的生化药物，具有多种生物活性，因其特有的生物活性而广泛用于医学领域，目前国内外市场的需要量比较大，CS的检测方法也多种多样，各有其特点，应根据要求加以选择。分光光度法操作烦琐，重现性差，且干扰因素多，需经进一步改良，简化操作；一般的高效液相色谱法测定时由于紫外检测为短波长，基线噪音比较高，色谱峰容易拖尾；加入离子对试剂可以改善峰形，提高分离效果且基线稳定，专属性强；高效毛细管电泳专属性强，灵敏度高，应用范围广。随着检验条件和设备的不断进步，大型精密仪器的不断引进，CS含量测定的方法也将不断提高和完善，以满足CS及其制剂的质量控制的需求[20]。

1韩刚，原海忠.氨基葡萄糖与硫酸软骨素复方片的抗炎、镇痛作用[J].中国生化药物杂志，2010，31(1)：39

2陈磊，凌沛学.硫酸软骨素和玻璃酸钠联合应用治疗木瓜酶致兔膝骨关节炎[J].中国生化药物杂志，2009，30(1)33

3曹岳华，彭国庆.硫酸软骨素在医学上的应用概况[J].中南药学，2010，8(3)：222

4张天民，凌沛学.硫酸软骨素的过去、现在和将来[J].食品与药品，2010，12(1)：1

5姜玉红，张翊.硫酸软骨素含量测定的法定方法[J].食品与药品，2009，11(3)：68

6中国药典[S]．二部．2010: 984-986

7万秀玉，白若琬.咔唑法同时测定玻璃酸钠和硫酸软骨素的含量[J].药学实践杂志 2009，27(4)：282

8万秀玉，姜雯.含玻璃酸钠的复方硫酸软骨素滴眼液中硫酸软骨素的含量测定[J].中国生化药物杂志，2009，30(1)：43

9李明明，逯家辉.硫酸软骨素的结晶紫分光光度法测定[J].中国医药工业杂志，2008，39(1)：50

10逯家辉，李明明.荧光法测定硫酸软骨素含量的新方法[J].分析科学学报，2008，24(5)：561

11李艳平，吴拥军.化学发光法快速测定硫酸软骨素注射液的含量[J].华西药学杂志，2007，22(3)：331

12李继桃，李念兵.甲基紫硫酸软骨素共振瑞利散射光谱及其应用[J].分析测试学报，2007,26(2)：183

13徐志洲, 徐玉文.光度滴定法测定硫酸软骨素的含量.中国药品标准，2008,9(6):465

14林燕飞，孙静芸． HPLC-ELSD法测定复方氨基葡萄糖片中硫酸软骨素的含量[J].中国现代应用药学杂志，2006，23(5):388

15潘自国， 陶礼萍.硫酸软骨素的RP-HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2007，38(9)：659-661

16狄平平，劳苑子.HPLC法测定复方氨基葡萄糖片中盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素含量[J].中国药事，2010，24(3)：283

17石瑞平，胡海勋.离子对反相高效液相色谱法测定硫酸软骨素滴眼液的含量及有关物质[J].药物分析杂志，2008，8(9)：1574

18David J I，Roman M．Determination of chondroitinsulfate content in raw materials and dietary supplements by highperformanceliquid chromatography with ultraviolet detection afterenzymatic hydrolysis: single-laboratory validation[J]．J AOAC Int，2007，90(3): 659

19沈建如，陈振德.高效毛细管电泳法测定硫酸软骨素含量[J].中国生化药物杂志，2010，31(3)：197

20于海洲，范慧红.硫酸软骨素含量测定方法研究进展[J].中国生化药物杂志,2011，32(2)：160