卵清蛋白诱导的兔类风湿关节炎模型的建立及评估

刘 贺 陈 伟 王轶楠 江仲超 张颜博 王金成 常 非

(吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033)

卵清蛋白诱导的兔类风湿关节炎模型的建立及评估

刘 贺 陈 伟 王轶楠1江仲超 张颜博 王金成 常 非

(吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033)

目的建立并评估卵清蛋白(OVA)诱导的兔类风湿关节炎(RA)模型。方法于家兔肩胛间区的5个部位进行皮下注射OVA，每周1次，连续3 w，对RA组进行致敏，注射2 w后，在兔双侧关节腔内注射OVA建立RA模型。对照组以同样方法注射等量的生理盐水。建模后每周分别用千分游标卡尺和电子体温计测量关节直径和关节表面皮肤温度;第1、4、8周采用ELISA试剂盒检测各组家兔外周血清中的IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平;于建模后第1、4、8周处死家兔，取腹股沟淋巴结，用不同浓度OVA刺激淋巴细胞增殖，检测淋巴细胞对特异性抗原的反应;HE染色观察膝关节滑膜增生、软骨破坏程度及缺损周围组织炎性细胞浸润情况。结果RA组家兔关节腔注射OVA后1 w，关节直径明显增大，表面皮肤温度明显升高，随后逐渐降低至稳定的水平，但仍明显高于对照组;在关节腔注射抗原后第1、4、8周，RA组血清中IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平较对照组均显著升高(P＜0.01);RA组淋巴细胞增殖实验与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);RA组家兔关节滑膜大量增生，第8周时软骨破坏明显;组织切片可见滑膜组织大量增生，炎症细胞浸润，软骨层破坏。结论OVA诱导的兔RA模型能够很好地模拟人RA病理过程，可成为研究RA的理想的动物模型。

卵清蛋白;类风湿关节炎

类风湿关节炎(RA)是一种常见的慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病，以关节和关节周围组织非化脓性炎症为主要特征，影响着0.05% ～1%的人群〔1〕。目前，研究RA的常用动物模型仍是弗氏佐剂诱导的AA模型〔2〕、Ⅱ型胶原诱导的CIA模型〔3〕，这两种模型适用于小鼠和大鼠。兔的膝关节较大，易于进行药品注射及细胞移植治疗，且它与人的手足小关节大小相近，对指导RA好发部位的治疗很有意义〔4〕。卵清蛋白(OVA)作为一种外源性抗原已被广泛应用于主动致敏来建立如变应性鼻炎、支气管哮喘的动物模型等〔5，6〕。OVA可以引起嗜酸性细胞、肥大细胞以及淋巴细胞的集聚，较好地模拟了免疫性疾病的微环境。本研究通过关节腔内注射OVA诱导兔RA模型〔7〕，并对其进行评估。

1 材料与方法

1.1 实验动物 家兔30只，10周龄，体重(1.8±0.2)kg，购自吉林大学医学院基础实验动物中心，动物合格证号:SYXK(吉)2007-0012。

1.2 RA模型建立 1 ml OVA乳剂(含OVA 10 mg)，于兔肩胛间区的5个部位进行皮下注射，每周1次，连续3 w，对照组于同样部位注射等量的生理盐水。注射2 w后，将家兔固定于手术台上，对双膝关节部位进行除毛，酒精消毒，在胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点的髌韧带两侧、垂直于皮肤进针1 cm(穿破关节囊时有突破感)，双膝各注射0.5 ml OVA乳剂(含OVA 5 mg)，对照组注射等量的无菌生理盐水。

1.3 RA模型的鉴定及评价

1.3.1 一般体征观察 家兔的体重、饮食量、尿便、毛发光泽、活动状态以及关节外观改变。

1.3.2 家兔关节直径和关节表面温度的检查 在建模前、建模后，每隔1 w，用电子体温计测量家兔髌韧带中点关节皮肤表面体温，将兔膝关节屈曲90°，用千分游标卡尺在兔胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点平面测量关节直径。

1.3.3 血液学检查 在建模后第1、4、8周耳缘静脉取血，离心上层血清，－20℃保存备用。检测白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α以及抗OVA抗体(抗OVA IgG)，具体步骤按ELISA试剂盒说明操作。

1.3.4 特异性抗原淋巴细胞增殖实验 在建模后第1、4、8周时随机处死对照组和RA组家兔各5只，在无菌条件下，取腹股沟淋巴结，研磨计数铺板，分别加入 0，0.2，1，5，25 μmol/L 的OVA溶液，培养24、48 h，MTT法测淋巴细胞增殖。

1.3.5 关节病理标本制作和观察 剪除髌骨和相关肌肉及韧带，用摆锯将远端股骨和近端胫骨截断后固定于4%的多聚甲醛中1 w，放于0.5 mol/L的乙二酸四乙酸溶液中脱钙，至针头能够刺入为止。包埋后用切片机切成5μm厚的切片;HE染色观察滑膜增生、周围组织炎性细胞浸润、软骨和软骨下骨破坏情况。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，两样本之间进行t检验。

2 结果

2.1 一般体征及体重的变化 与对照组相比，RA组家兔在免疫初期，饮食量、精神状态、自主活动等均无明显改变。随着免疫次数的增多，动物食欲减退、体重增长减慢、毛色稀疏发黄、活动减少;在关节腔注射OVA之后关节严重肿胀，随着时间的延长，出现炎症小结，后肢关节硬化、并逐渐丧失运动功能。

2.2 家兔关节直径和关节表面温度的变化 与对照组相比，RA组在膝关节注射抗原后，关节直径明显增大(P＜0.01);建模后第1周关节直径增大的峰值期，随后有所降低并趋于稳定。RA组在膝关节注射抗原后，与对照组相比，关节表面温度明显升高(P＜0.01)，建模后第1周为皮温升高的峰值期，随后有所降低并趋于稳定。见图1。

2.3 家兔血清中的IL-1、TNF-α和抗OVA IgG的ELISA的检测结果 与对照组相比，建模后第1、4、8周RA组血清中IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平有明显升高(P＜0.01)。见表1。

表1 两组在不同时间点IL-1、TNF-α、抗OVA IgG的比较(±s，n=5，ng/L)

表1 两组在不同时间点IL-1、TNF-α、抗OVA IgG的比较(±s，n=5，ng/L)

与RA组比较:1)P＜0.01

1 w 4 w 8 w 抗OVA IgG组别 IL-1 TNF-α 1 w 4 w 8 w对照组 62.40±15.221)72.50±13.421)70.49±12.211)319.03±53.971)330.04±55.621)335.87±42.741)152.21±21.241)160.34±18.951)145.47±25.531)1 w 4 w 8 w±33.64 278.87±36.09 282.25±32.55 RA组 154.58±22.43 133.63±31.32 126.63±36.25 460.96±44.78 477.04±54.68 496.47±43.02 235.26

图1 家兔关节直径和表面温度变化

2.4 OVA刺激淋巴细胞增殖 淋巴细胞在较高OVA浓度(＞1μmol/L)刺激时出现细胞增殖差异，培养24和48 h后RA组和对照组相比淋巴细胞增殖明显增多(P＜0.05)。见图2。

2.5 家兔关节外观的变化 大体观察可见对照组兔关节滑膜亮白，层次较少，软骨表面光滑透明，无缺损;RA组兔关节滑膜大量增生，颜色灰白，层次增多，软骨色泽变暗，第8周可见明显的软骨缺损。见图3。

图2 不同浓度OVA刺激淋巴细胞24和48 h增殖情况

2.6 滑膜组织学观察结果 组织切片可见对照组兔膝关节滑膜内膜细胞正常，无增生和炎性细胞浸润(图4A)。RA组可见滑膜内膜细胞增生肥大，炎症细胞浸润，其中以T淋巴细胞为主，滑膜血管增生(图4B)。滑膜组织内见Russell小体(空心箭头)形成，滑膜细胞增生导致形成多核巨细胞(实心箭头)(图4C)。滑膜淋巴细胞聚集成环形，形成淋巴滤泡，淋巴小结周围可见浆细胞套状浸润(图4D)。米粒样小体黏附在滑膜上、从滑膜上长出或游离在关节腔内(黑色箭头所示)(图4E和4F)。

2.7 软骨HE染色 正常软骨表面光滑，表面无血管翳包裹，软骨细胞充实，软骨层较厚(图5A)。RA组软骨被增生的滑膜和纤维组织包裹(图5B)，关节软骨层变薄，发生软骨溶解，软骨细胞核和细胞体消失，呈现白色是软骨溶解标志，可以通过苍白的染色和软骨陷窝的扩张得到证实(图5C)。在RA中，由血管、炎性细胞和增生的成纤维细胞组成的肉芽组织侵入和越过关节软骨，血管翳在关节内和关节周围生长，随后从关节软骨表面越过，并紧紧包裹关节软骨和软骨下骨(图5D、图5E)。严重者软骨可完全溶解达到软骨下骨(图5F)。

图3 两组家兔大体观察

图5 两组软骨HE染色

3 讨论

小鼠体积较小，且在形态学上与人类相差较远，因此，在某些特殊的实验中，与人类亲缘关系较近的或体型较大的动物往往会更适合。RA是淋巴细胞、中性粒细胞和细胞因子之间互相介导的免疫反应，最终导致不可逆的严重的炎症性组织损伤，炎性组织逐渐覆盖关节面，形成所谓的血管翳，关节软骨甚至软骨下骨均被破坏〔8〕。鸡OVA诱导家兔RA模型的机制是通过反复皮下注射鸡OVA，使体内产生抗OVA抗体，随后在关节腔内再次注射抗原，抗体与抗原结合后沉积于关节软骨和滑膜上〔9〕，刺激机体的补体系统和细胞免疫，而T淋巴细胞和细胞因子TNF-α、IL-1在介导RA炎症反应及组织损伤过程中起着重要的作用〔10〕，目前认为IL-1是参与RA进展期关节破坏的典型前炎症细胞因子，而TNF-α参与RA的炎症反应过程，在临床上，RA患者血清中炎性细胞因子IL-1和TNF-α水平有明显的升高〔11〕。本研究说明在RA进展中，B淋巴细胞被活化并分泌抗体。OVA对家兔的淋巴细胞产生了特异性刺激，T淋巴细胞和B淋巴细胞的共同参与了关节炎的进展，与临床上RA患者表现一致〔12〕。

OVA和弗氏完全佐剂所制作的乳剂诱导关节炎模型的关键在于乳剂的乳化程度是否完全，滴于冰水中完全不扩散是检测乳剂是否成功的指标，并且在乳剂制备后应尽早注入皮下，以免长期放置导致OVA与佐剂分离，影响模型成功率。完全乳化的乳剂能在皮下缓慢释放抗原，对动物进行长时期的刺激作用，延长致敏时间，可以有效、稳定地激活机体的免疫反应，从而提高动物模型制备的稳定和可靠性。本实验制备的模型与人类临床上的RA病理机制相符，且致敏率高，整个过程中无需麻醉，评估方法简单可靠。

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Establishment and evaluation of rabbit rheumatoid arthritismodel induced by ovalbum in

LIU He，CHEN W ei，WANG Yi-Nan，et al.
Department of Osteology，China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China

ObjectiveTo establish and evaluate rabbit rheumatoid arthritis(RA)model induced by ovalbumin(OVA).M ethods

After continuous subcutaneous injection of OVA at 5 points of scapular area each week to sensitize RA group rabbits for three weeks，2 weeks later after sensitization，OVA was injected into the intra-articular of each knee to induce RAmodels.And control group were given the same amount of saline in the sameway.The jointdiameter and surface skin temperature changed withmicrometer caliper and electronic clinical thermometer weekly;IL-1，TNF-αand anti-OVA IgG levels in the serum were determined with ELISA Kits at first，fourth and eighth week.Rabbitswere sacrificed at the second，fourth and eighth week after articular injection to obtain inguinal lymph nodes stimulated by different concentrations of OVA for lymphocyte proliferation test to detect lymphocyte responses to specific antigen.The knees and synovial tissue were removed to observe synovialhyperplasia，cartilage destruction and inflammatory cells infiltration by HE staining.ResultsThe joint diameter and surface skin temperature of RA group increased significantly after articular injection for a week，then gradually reduced to a stable level，but still significantly higher than those of control group.The IL-1，TNF-αand anti-OVA IgG levels in the serum of RA group were significantly higher than those of control group at the first，fourth and eighth week(P ＜0.01);Lymphocyte proliferation test also indicated statistically significant difference(P＜0.05)between the two groups.Macroscopic observation showed obvious synovial hyperplasia and cartilage destruction sacrificed at eighth week.Tissue sections showed synovial tissue hyperplasia，inflammatory cells infiltration and cartilage destruction.ConclusionsRA model induced by OVA can imitate the pathological process of human RA very well，offering an ideal animal model of RA.

Ovalbumin;Rheumatoid arthritis

R593.22

A

1005-9202(2013)12-2799-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.031

国家自然科技基金面上项目(No.81171681);高等学校博士学科点专项科研基金(新教师基金)(No.20090061120081)

1 吉林大学第一医院转化医学研究院

常 非(1975-)，男，副教授，副主任医师，主要从事足踝外科及软骨再生研究。

刘 贺(1988-)，男，硕士，主要从事软骨再生及类风湿关节炎研究。

〔2013-01-19收稿 2013-04-07修回〕

(编辑 张 慧)