黄芩毛状根中总黄酮的提取工艺

施春阳， 齐香君， 钱卫东， 徐方稳， 郝红梅

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西三正药业有限公司， 陕西 咸阳 712000； 3.陕西康惠制药股份有限公司， 陕西 咸阳 712000)

0 引言

中药黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)为唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1]，临床应用广泛.近年来，因黄芩药材资源的长期过度开发和破坏，出现了资源紧缺、供不应求的问题.总黄酮是黄芩的主要药用成分，其主要有效成分黄芩苷和黄芩素具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用[2-4].相关研究表明[5,6]，黄芩毛状根组织培养能有效积累黄芩苷和黄芩素等黄酮类物质，特别是黄芩苷的含量甚至超过了传统中药材.本文以黄芩毛状根为材料，研究了利用大孔吸附树脂从中提取总黄酮的工艺，从而为黄芩药用成分的提取和资源开发开辟了一条新的途径.

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

黄芩毛状根干品：黄芩毛状根经改良的1/2 MS液体培养基通气暗培养50 d，取出，70 ℃烘干.黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，110715-201016)，各种树脂(西安蓝晓科技有限公司)，其他试剂为分析纯.

UV-9100紫外可见分光光度计，北京瑞利；6100A植物罐，上海高机生物；AJ5800电子输液泵，上海安洁电子；PHS-3C 酸度计，上海精科.

1.2 黄芩毛状根总黄酮上样液的制备

取80.00 g黄芩毛状根干品，分别加10倍量和8倍量水煎煮二次，每次1.5 h，合并滤液，浓缩至原体积的1/2，用HCl调pH 至4.0，冷藏过夜，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液并用水定容至1 000 mL[7].经测定，上样液中总黄酮含量为11.30 mg·mL-1.

1.3 总黄酮含量的测定

1.3.1 黄芩苷标准曲线的制作

取105 ℃恒重的黄芩苷对照品0.014 4 g，甲醇溶解并定容至100 mL，得135.36μg·mL-1黄芩苷标准液.分别取上述标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL于25 mL容量瓶，水定容后在274 nm下测定吸光值A[8].以A对黄芩苷浓度作标准曲线，计算标准曲线的回归方程.

1.3.2 样品液中总黄酮含量的测定

取待测样品液，稀释适当倍数，按“1.3.1”项的方法测定吸光值A.由公式1计算样品液的总黄酮含量.

(1)

其中：A— 吸光值；n— 稀释倍数.

1.4 总黄酮提取工艺的考察

根据总黄酮含量测定结果，以总黄酮吸附量、解吸率和回收率为指标，优选树脂型号，并考察不同上样和洗脱条件对总黄酮提取效果的影响，并绘制所选树脂的泄漏曲线和洗脱曲线，确定最佳提取工艺，最后考察该工艺的稳定性和树脂的重复使用次数.总黄酮解吸率和回收率分别按公式2和3计算.

(2)

(3)

2 结果与讨论

2.1 黄芩苷标准曲线方程

经测定，黄芩苷含量测定的标准曲线方程为：Y=0.055 4X+0.002，r=0.999 9，说明在2.7～16.2μg·mL-1范围内黄芩苷的线性关系良好.

2.2 树脂型号的确定

取各种型号树脂1.00 g，加15 mL含总黄酮11.30 mg·mL-1的上样液，于摇床中100 r·min-1振摇吸附24 h，测定上样液中残余总黄酮的浓度，计算每克湿树脂的总黄酮吸附量；用去离子水洗树脂数次，加95%乙醇150 mL，振摇解吸附24 h，测定解吸液中总黄酮的浓度，由公式2计算解吸率，结果见表1.

表1 树脂型号的确定

由表1可知，综合考虑各种树脂的总黄酮吸附量和解吸率，LX-22大孔吸附树脂对黄芩毛状根总黄酮的提取效果最佳.

2.3 上样工艺的考察

2.3.1 上样液浓度对总黄酮吸附性能的影响

以相同流速将浓度分别为1.79、3.90、6.28、8.69和11.30 mg·mL-1的上样液通过LX-22树脂柱，动态吸附至流出液经2%氯化铁检查呈阳性，去离子水洗树脂柱至水洗液检查呈阴性，测定流出液和水洗液的总黄酮浓度，计算每克湿树脂的总黄酮吸附量[9]，结果见图1.由图1可以看出，上样液浓度在8.69 mg·mL-1时，LX-22大孔吸附树脂对总黄酮的吸附量最高.

图1 上样液浓度对总黄酮吸附性能的影响

2.3.2 上样速度对总黄酮吸附性能的影响

将浓度为8.69 mg·mL-1的上样液分别以相当于湿树脂重量2、4、6和8 BV·h-1的流速通过LX-22树脂柱，按“2.3.1”方法操作，计算每克湿树脂的总黄酮吸附量.再用95%乙醇进行洗脱，测定洗脱液中总黄酮含量，由公式3计算总黄酮的回收率，结果见表2.

表2 上样速度对总黄酮吸附性能的影响

由表2可知，综合考虑总黄酮的吸附量和回收率，上样速度在6 BV·h-1时，LX-22大孔吸附树脂对总黄酮的提取效果最好.

2.3.3 树脂柱径高比对总黄酮吸附性能的影响

将8.69 mg·mL-1上样液以6 BV·h-1流速通过径高比分别为1∶8、1∶14和1∶20的LX-22树脂柱，其余操作同“2.3.2”，计算总黄酮的吸附量和回收率，结果见表3.

表3 树脂柱径高比对总黄酮吸附性能的影响

由表3可知，综合考虑总黄酮的吸附量和回收率，树脂柱径高比为1∶14时，LX-22大孔吸附树脂对总黄酮的提取效果最好.

2.3.4 泄漏曲线的考察

按上述确定的最佳吸附条件将上样液通过LX-22树脂柱，分段收集流出液，每份50 mL，测定每份流出液中总黄酮浓度，直至树脂饱和，绘制泄漏曲线[10]，见图2.

图2 泄漏曲线

如图2所示，当上样液体积为湿树脂重量的13 BV时，流出液中总黄酮浓度突然增大，说明上样液总黄酮开始明显泄漏，此时LX-22大孔吸附树脂对总黄酮的吸附量约为113.0 mg·g-1.

2.4 洗脱工艺的考察

2.4.1 洗脱剂浓度对解吸性能的影响

按上述确定的最佳吸附条件使LX-22大孔吸附树脂柱吸附总黄酮至饱和，用去离子水洗至流出液经2%氯化铁检查呈阴性，再用不同浓度的乙醇进行洗脱，以考察不同浓度乙醇的洗脱效果，结果见表4.

表4 洗脱剂浓度对解吸性能的影响

由表4可知，综合考察总黄酮的解吸率和回收率，70%乙醇最适合LX-22大孔吸附树脂中总黄酮的洗脱.

2.4.2 洗脱速度对解吸性能的影响

按确定的最佳吸附条件使LX-22大孔吸附树脂柱吸附总黄酮至饱和，用去离子水洗至流出液经2%氯化铁检查呈阴性，再用70%乙醇分别以相当湿树脂重量4、6、8和10 BV·h-1的流速洗脱，结果见表5.

表5 洗脱速度对解吸性能的影响

由表5可知，洗脱速度在4和6 BV·h-1时效果均较好，为加快洗脱速度，提高总黄酮提取效率，选择最佳洗脱速度为6 BV·h-1.

2.4.3 洗脱曲线的考察

上样液按照确定的最佳工艺进行上柱、吸附和洗脱，分段收集洗脱液，测定每份洗脱液总黄酮浓度，绘制洗脱曲线，见图3.由图3可以看出，洗脱剂用量为3 BV时，洗脱液中总黄酮含量达50 mg·mL-1以上，随后快速下降，当洗至用量为相当于湿树脂重量的9 BV时，已能将总黄酮基本解吸完全.

图3 洗脱曲线

2.5 验证实验

称预处理好的LX-22树脂5.00 g共3份，按上述最优条件进行装柱、上样吸附和洗脱，计算树脂对黄芩毛状根总黄酮的吸附量和总黄酮的回收率，验证工艺稳定性[11]，结果见表6.

表6 验证实验结果

如表6所示，在试验确定的提取工艺条件下，LX-22大孔吸附树脂对黄芩毛状根中总黄酮的平均吸附量和总黄酮回收率分别达113.6 mg·g-1和82.6%，说明本工艺的提取效果稳定.

2.6 树脂重复使用次数的考察

按最佳工艺条件在同一LX-22树脂柱上重复进行上样、水洗和洗脱数次，分别计算总黄酮吸附量，确定树脂的重复使用次数[12].结果表明树脂重复使用第二和第三次时，总黄酮吸附量分别降至第一次的81.3%和49.6%，树脂由白色变为灰黄色.综合考虑树脂的生产成本和提取效果，建议重复使用2～3次需用95%乙醇进行再生处理.

3 结论

采用LX-22大孔吸附树脂从黄芩毛状根中提取总黄酮的工艺条件为：浓度为8.69 mg·mL-1上样液，以相当于湿树脂重量6 BV·h-1的流速通过径高比为1∶14的树脂柱，上样体积为13 BV，用去离子水洗树脂柱至流出液经2%氯化铁检验呈阴性，以70%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为6 BV·h-1、洗脱剂用量为9 BV，将洗脱液浓缩结晶，即得黄芩毛状根总黄酮.在所确定的优化工艺条件下，LX-22大孔吸附树脂可有效地提取黄芩毛状根中的总黄酮，树脂对总黄酮的吸附量达113 mg·g-1，总黄酮的回收率超过82%.

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2005:211-212.

[2] 胡世林,冯学峰.黄芩研究的某些新进展[J].中国药学杂志,2001,36(11):728-731.

[3] 延卫东,王瑞君,何 琰,等.黄芩苷药理作用研究进展[J].陕西中医,2002,23(12):1 127-1 129.

[4] 侯艳宁,朱秀媛,程桂芳,等.黄芩苷的抗炎机理[J].药学学报,2000,35(3):161-164.

[5] 齐香君,郭乐康,陈微娜.诱导子对黄芩毛状根生长及黄芩苷合成的影响[J].中草药,2009,40(5):801-803.

[6] 齐香君,李 雅,施春阳.光质对黄芩毛状根生长及黄芩苷含量的影响[J].安徽农业科学,2012,52(6):3 334,3 411.

[7] 施春阳,齐香君. 基于PKa值的酸醇超声法提取黄芩苷的研究[J].陕西科技大学学报,2010,28(2):73-76.

[8] 李云鹏,黄 芸,魏春娥,等.紫外分光光度法测定黄芩中总黄酮含量[J].河北中医药学报,2007,22(1):36-37.

[9] 周小华,陈 器,吴方国.D241树脂分离纯化黄芩总黄酮的研究[J].离子交换与吸附,2002,18(1):36-44.

[10] 魏元锋,刘新国,韩建伟,等.HP20树脂纯化黄芩总黄酮的研究[J].湖北中药杂志,2007,29(2):50-51.

[11] 刘彬果,钟 蕾,郭文勇,等.大孔树脂吸附法对黄芩总黄酮富集纯化工艺的研究[J].第二军医大学学报,2004,25(5):562-564.

[12] 徐 晶,陈再兴,袁昌鲁.大孔吸附树脂富集纯化黄芩总黄酮的工艺研究[J].中医药学刊,2006,24(9):1 648-1 649.