半枝莲多糖提取及抗氧化性研究

黄秀香，李晓东，劳德永

（河池学院化学与生命科学系，广西宜州546300）

中药半枝莲为唇形科植物半枝莲（Scutellaria barbata D．Don）的干燥全草。具有解热、抗癌、免疫调节等药理作用[1]。半枝莲含有多糖、生物碱、黄酮甙、甾体以及酚类、鞣质等。多糖是一类重要的活性物质，特别在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力等方面受到越来越多药学研究工作者的关注。多糖类是保健食品中真正起作用的生理活性部分，是保健食品的核心。多糖是半枝莲中一种重要的活性成分，因此，对半枝莲多糖最佳提取工艺及抗氧化研究有很高的价值。本实验研究了超声波辅助半仿生法在半枝莲多糖提取中的可行性，用正交试验对此工艺进行优化，寻求最佳的提取工艺条件，并对半枝莲多糖抗氧化活性进行研究，以期为半枝莲药理作用的进一步研究和半枝莲资源的合理开发提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

半枝莲干品（购于广西宜州市）；葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、95 %乙醇、盐酸、磷酸氢二钠、K3Fe（CN）6、三氯乙酸、FeCl3、邻二氮菲、FeSO4、H2O2、石油醚，以上药品均为分析纯。

UV－2501 紫外分光光度计：日本岛津；AR224CN型电子分析天平：奥豪斯仪器有型公司；KQ2200DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-25 型数显pH 计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 半枝莲多糖提取工艺

根据仿生学原理，模仿人体胃、小肠pH 分别为2.0、7.5。准确称取1 g 半枝莲样品，第一次提取：用pH已调至2.0 的蒸馏水作为浸剂，在一定提取时间、料液比、提取温度、超声功率下进行多糖提取，过滤，保留滤液、滤渣。第二次提取：用pH 为7.5 的蒸馏水作提取剂，在相同的提取时间、超声功率、料液比、提取温度下对第一次提取后的滤渣进行多糖提取，过滤。合并两次滤液，加入活性炭脱色，减压抽滤，滤液浓缩，用95%乙醇沉淀，常压过滤，用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，在烘箱中60 ℃烘干即得到半枝莲粗多糖。

1.2.2 多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的制作[2]

准确称取105 ℃下干燥的无水恒重葡萄糖0.100 0 g，溶于100 mL 容量瓶中，定容，摇匀，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 浓度为1 mg/mL 的葡萄糖标准液于50 mL 容量瓶中，定容，摇匀，分别吸取定容后的葡萄糖标准液2.0 mL 于10 mL 具塞比色管中，以蒸馏水为空白对照，加入1.0 mL5%苯酚溶液、5.0 mL浓硫酸，室温静置30 min，在波长为490 nm 下测定吸光度，以吸光度A 为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.2.2 换算因子的测定[3]

准确称取半枝莲多糖121 mg 置于100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取配置好的多糖溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 于50 mL 容量瓶中，定容后分别吸取2 mL 于比色管中，加入1 mL新配置的5%苯酚和5 mL 浓硫酸，振荡，静置30 min后测定其吸光度。

1.2.2.3 样品中总糖含量测定[4]

吸取样品液1.0 mL，按1.2.2.1 操作，测定吸值，以标准曲线方程计算多糖得率。多糖得率计算：多糖得率/%=（CDf×100%）/W（式中：C 是半枝莲多糖溶液中葡萄糖的质量浓度；D 是多糖溶液的稀释倍数；f 是换算因子；W 是半枝莲样品的质量）。

1.2.3 多糖提取条件的优化

分别进行单因素试验，对比不同提取时间、料液比、超声功率、提取温度对多糖得率的影响，在单因素的基础上采用正交试验半枝莲多糖的提取条件进行优化。

1.3 抗氧化试验

1.3.1 还原能力的测定[4]

配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的多糖液，分别加入pH 为6.6 的磷酸盐缓冲液和1 %K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL 并混合均匀，混合液在50 ℃下保温20 min 后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后在3 000r/min离心10min。取上清液0.5mL，加入5.0mL 蒸馏水及0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，在700 nm 处测定反应液的吸光度。以VC作对比，每组3 个平行。

1.3.2 对羟基自由基清除作用的测定[4]

取1 mL 5 mmol/L 邻二氮菲，加2.0 mL pH7.4 的磷酸盐缓冲液，充分摇匀，加1.0 mL 7.5 mmol/LFeSO4，摇匀，加1.0 mL 0.2%H2O2，最后加入5 mL 重蒸水，在37 ℃水浴下反应60 min，然后在536 nm 波长测定吸光度A损伤。未损伤管以1mL 重蒸水代替损伤管中1mL 0.2%的双氧水，操作同损伤管，可测得未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管分别以1 mL 浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的多糖液和4 mL 的重蒸水代替损伤管的5 mL 重蒸水，操作同损伤管，可测得样品管的吸光度值A样。以VC作对比，每组3 个平行。

羟基自由基清除率d 计算公式：

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制作结果

根据1.2.2.1 制作得到回归方程为：Y=12.121X+0.008 1，R2=0.999 2。

2.2 换算因子计算结果

根据1.2.2.2 测定的吸光度以及回归方程，按下式计算换算因子：f＝w/（C×D）（式中：w 是称取多糖的质量；C 是多糖中葡萄糖的质量浓度；D 是半枝莲多糖的稀释倍数），经计算得f=2.7。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取时间对多糖提取率的影响

准确称取半枝莲1.000 0 g，在提取温度50 ℃，料液比1 ∶25（g/mL），超声功率70 W，pH 分别为2.0、7.5时提取多糖，结果如图1。

图1 提取时间对得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield

半枝莲多糖的得率随着提取时间的延长而增大，在25 min 时提取率达到最大，继续延长提取时间，提取率减小，由于在一定温度下多糖部分水解所造成的。故选择提取时间在20 min～30 min 作为进一步优化提取条件的提取时间范围。

2.3.2 料液比对多糖提取率的影响

准确称取半枝莲1.000 0 g，在提取温度50 ℃，超声功率70 W，提取时间25 min，pH 分别为2.0、7.5 时提取多糖。料液比分别为1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），结果如图2。

图2 料液比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of weight ratio of scutellaria barbata D．Don to ethanol on the extraction yield

多糖的提取率随着料液比的增大而增大，料液比达到1 ∶20 时多糖的提取率达到最大，随着料液比的继续增大，多糖的提取率反而减小，这可能是多糖的溶出量已达到平衡，过多的溶剂造成多糖的浓度变小。故选择料液比1 ∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）作为进一步优化提取条件的料液比范围。

2.3.3 超声功率对多糖提取率的影响

准确称取半枝莲1.000 0 g，在提取时间25 min，温度50 ℃，料液比1 ∶20（g/mL），pH 值分别为2.0、7.5 时提取多糖，超声功率分别为50、60、70、80、90 W，结果如图3。

图3 超声功率对多糖得率的影响Fig.3 Effect of power on the yield of polysaccharide

由图3 可知，多糖的提取率随着超声功率的增大而增加，到80 W 时提取率达到最大，当功率大于80 W后多糖的提取率降低，原因可能是功率过高破坏了多糖结构。90 W 时的提取率与60 W 的基本相同，但90 W时耗能较大，因此，选择60 W～80 W 作为进一步优化提取条件的超声功率范围。

2.3.4 提取温度对多糖提取率的影响

准确称取半枝莲1.000 0 g，在提取时间25 min，料液比1 ∶20（g/mL），功率70 W，pH 分别为2.0、7.5 时提取多糖，提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，结果如图4。

图4 提取温度对多糖得率的影响Fig.4 Effect of temperature on the yield

由图4 可知，随着提取温度的升高多糖的提取率略有增大，当温度达到50 ℃时提取率达到最大，当温度继续升高时提取率反而降低，原因可能是较高的温度破坏了多糖结构。因此，选择40 ℃～60 ℃作为进一步优化提取条件的提取温度范围。

2.4 正交试验优选多糖提取工艺

2.4.1 正交试验因素与水平的选择

根据单因素的最佳工艺范围，设计因素水平表。见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels

2.4.2 正交试验设计及结果

正交试验设计及结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

从表2 可以看出，各因素对提取效果影响的主次顺序为提取时间＞提取温度＞超声功率＞料液比。最佳提取条件为A3B2C2D3，即提取时间30 min，料液比1 ∶25（g/mL），超声功率70 W，提取温度60 ℃。在最佳工艺条件下提取多糖得率为1.48%，RSD 为1.29%。

2.5 半枝莲多糖抗氧化性试验结果

2.5.1 还原能力的测定结果

还原能力的测定结果见图5。

图5 半枝莲多糖还原能力测定Fig.5 Reducing power of polysaccharide from scutellaria barbata D．Don

由图5 可知，半枝莲多糖具有还原能力，在一定的浓度范围内，还原能力随多糖浓度增加而增强。但与VC相比，其还原力较弱。

2.5.2 对羟基自由基清除作用的测定结果

对羟基自由基清除作用的测定结果，见图6。

图6 半枝莲多糖对·OH 清除作用的测定Fig.6 The scavenging effects of polysaccharide on·OH

由图6 可知，半枝莲多糖液对羟基自由基有清除作用，在一定浓度范围内，清除率随多糖液浓度增大而增强，半枝莲多糖对超氧自由基的IC50为1.70 mg/mL，VC的IC50为1.61 mg/mL，半枝莲多糖对超氧自由基的清除能力略低于VC。

3 结论

采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，以多糖提取率为考察指标，用正交试验法L9（34）对实验的提取时间、料液比、超声功率、提取温度4 个因素进行考察，确定最佳提取工艺为A3B2C2D3，即提取时间30 min，料液比1 ∶25（g/mL），超声功率70 W，提取温度60 ℃，并对结果进行验证，在此最优条件下半枝莲多糖的提取率最高为1.48 %，RSD 为1.29 %，说明该工艺可行、稳定。试验结果表明半枝莲多糖具有抗氧化性且在一定的浓度范围内，抗氧化能力随浓度的增大增强，超过一定浓度时，抗氧化能力趋于平稳，且比VC较弱。

本研究利用超声辅助半仿生法提取，提高了半枝莲多糖提取的效率，为半枝莲多糖提取的最佳工艺研究提供了参考，同时也为半枝莲多糖的抗氧化性研究提供了实验依据，对大面积筛选抗氧化药物有重要的价值，对半枝莲的进一步的研究和开发利用有重要意义。

[1] 蒋小岗,顾振纶．半枝莲的化学成分和药理作用[J]．中国野生植物资源,2004,23(1):3-5

[2] 韩冰,李全宏．花生多糖的提取工艺优化及抗氧化活性[J].食品研究与开发,2010,31(12):55-58

[3] 黄秀香,赖红芳,罗丽程.超声波协同复合酶法提取半边莲多糖工艺优选[J].中国实验方剂学,2012,18(5):44-46

[4] 沈蔚,任晓婷,张建,等．芦根多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].时珍国医国药,2010,21(5):1078-1080