紫外线诱变木醋杆菌及优良突变菌种的选育

蔡兴蓉，刘冬梅，许燕娜，肖性龙，袁琨

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

纤维素（Cellulose）是自然界最丰富的高分子物质，但植物中木质素、半纤维素等的存在，使得高纯度纤维素的提取、精制成为工业领域的一项重大技术难题[1]。部分细菌在发酵培养液中能生产纤维素，称细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC），它作为一种新型的生物材料，具有纯度高、结晶度高、机械强度高、吸水量高及生物相容性好等优点，可广泛应用于食品工业、化妆品业、造纸工业、声音振动膜、液晶材料、人造皮肤、药物载体等众多领域[2-3]。

在木醋杆菌（Acetobacter xylinum）、根瘤菌属（Rhizobium）、土壤杆菌属（Agrobactetium）及假单细胞菌属（Pseudomonas）等能发酵产生BC 的细菌中，木醋杆菌是产BC 能力最强的菌株[3-4]。BC 是由Acetobacter xylinum 静止浅盘培养产生，形成凝胶状坚固的网络纤维膜（净聚合物/水分=1/100），具有很好的持水性，但是这种方法存在一些弊端如浅盘表面积大易造成发酵液大量挥发损失，生长缓慢发酵时间长等，导致了生产成本的提高[5-7]；为提高BC 产量和生产菌株的稳定性，很多人进行了相关的研究：1-甲基环丙烯能提高木醋杆菌产BC 的产量[8]；采用超高压、紫外线、亚硝酸盐分别诱变能得到高产的菌株[9-11]；用紫外线和硫酸二乙酯进行复合诱变菌株产BC 干重为8.00 g/L[12]；在Acetobacter xylinum BPR2001 菌株中克隆了一段二鸟苷酸环化酶（DGC1）基因，构建了一株DGC1 基因缺失的突变菌株DD 在发酵罐中发酵产量提高36%[13]。尽管如此，还是普遍存在生产菌株不稳定、BC 发酵得率较低、生产成本较高及发酵原料单一等诸多问题，因此，研究提高生产菌株的稳定性、产量以及筛选经济发酵原料显得非常必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

木醋杆菌Acetobacter xylinum CGMCC 5173，为华南理工大学轻工与食品学院食品质量与安全实验室保存菌株。

1.1.2 主要仪器

PYX2190S2A 恒温培养箱：科力电器公司；GZX-9140MBE 数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；HHS-11-2 电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；01J2003-04 型立式高压蒸汽杀菌锅：上海博讯实业有限公司；SW-CJ-1F 无菌台：上海博讯实业有限公司；PHS-3C pH 计：上海精科实业有限公司；250 mL 锥形瓶、50 mL 锥形瓶、小平皿、大平皿、试管、涂布棒、烧杯、玻棒和紫外灯等市售。

1.1.3 主要试剂

蛋白胨、酵母提取粉、琼脂：广东环凯微生物科技有限公司；蔗糖、盐酸、95 %乙醇、KH2PO4、MgSO4·H2O、（NH4）2SO4、柠檬酸、NaOH（分析纯）：广州市化学试剂厂。

1.1.4 培养基配方

1）活化用水合培养基（Mixed Medium for Reviving，简称MMR）：蔗糖4%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.2%、蒸馏水100%；作斜面水合培养基为该培养基加入2.5%的琼脂，简称固体MMR。

2）发酵用水合培养基（Mixed Medium for Fermentation，简称MMF）：蔗糖6%、蛋白胨0.2%、酵母提取粉0.1 %、KH2PO40.3 %、MgSO4·H2O 0.1 %、（NH4）2SO40.2%、柠檬酸0.1%、95%乙醇1.5%、蒸馏水100%；倒平板水合培养基为该培养基加2.5%的琼脂，简称固体MMF。

3）发酵用椰汁培养基（Coconut Milk Medium for Fermentation，简称CMMF）：蔗糖4%、KH2PO40.3%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.4%、椰汁100%。

4）CO-MMF-CMMF：MMF 和CMMF 以4 ∶1 的比例混合得到的培养基。

1.2 方法

1.2.1 原菌株的活化

配取100 mL MMR 于250 mL 锥形瓶中经高压蒸汽灭菌后凉却至室温，从冰箱中取出野生型保存菌株，在无菌条件下从种子斜面上挑取BC 膜放进MMR中于30 ℃恒温箱活化2 d（30 ℃恒温培养BC 产量最高[14]）。2 d 后再配取100 mL MMR，从第一瓶MMR 中吸取4 mL 含菌液体于该MMR 中，于30 ℃恒温箱活化2 d。

1.2.2 菌株的紫外线诱变及其筛选

吸取活化好的菌液5 mL/小平皿中，将其放在紫外灯（功率为30 W）正下方25 cm 分别间隔照射3、4 min 和5 min（紫外线每照射1 min 关闭休息30 s 再照射1 min）。将诱变好的菌液分别吸取2 mL 涂布于大平皿内的固体MMF 上，于30 ℃恒温箱静态培养约5 d；观察大平皿中单菌落的生长情况，挑取最大，生长BC质量最好的单菌落，即优良的菌株于新配的MMR 中活化2 d。优良菌株命名方法：如UV31 表示为经过3 min 照射的1 株诱变菌株，其它的类推。

1.2.3 BC 的发酵生产及干重测定

以6%接种量吸取活化好的优良菌菌液于MMF中静态培养发酵，每菌株3 个平行30 mLMMF 于50 mL锥形瓶中培养；待发酵10 d 后将小锥形瓶中的菌液倒掉留下BC，往里加入0.1 mol/LNaOH 溶液使其刚好能浸没BC，然后放到100 ℃水中水浴20 min，取出水洗中性，然后将BC 倒出于已称过重量的小平板上，再放到烘箱中80 ℃烘约24 h 至恒重，称取质量。纤维素的产量表示为：纤维素质量与培养基体积比（g/L）[2]，测定结果表示为产量的平均值±标准偏差。

1.2.4 续代发酵生产BC

在收获前一代BC 前，以6%接种量吸取前一代MMF 中菌液于新配MMF 中静态培养发酵，每菌株3个平行30 mL MMF，待发酵10 d 后收获。称取干重的方法同上。

1.2.5 MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 种培养基培养比较

以6%接种量吸取野生株、UV32、UV42 菌菌液于新配MMR 中活化2 d，配取MMF、CMMF、CO-MMFCMMF（每瓶/30 mL），以6 %接种量将野生株、UV32、UV42 活化2 d 的菌液分别接种到3 种培养基中，每种培养基分别做3 个平行。发酵10 d 后，比较3 组BC 的厚度、颜色、质地及干重。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变菌株形态

紫外诱变菌株形态见图1。

图1 菌株木醋杆菌CGMCC 5173 经紫外线诱变不同时间后的菌落Fig.1 The colony of Acetobacter xylinum CGMCC 5173 mutated by UV for different time

通过不同时间的紫外诱变，观察到单菌落可知，诱变3、4 min 的效果比较好，能得到单菌落较多，且得到BC 饱满剔透，诱变5 min 菌生长单菌落极少，可见诱变5 min 的致死率很高。

2.2 优良菌株的BC 产量

诱变菌株纤维产量见表1。

表1 诱变菌株纤维产量Table 1 The BC yield of mutant strains g/L

在诱变得到单菌落中挑出个体较大，表观较好的单菌落，分别命名为UV31、UV32、UV33、UV42、UV44、UV51，将它们进行活化并投入生产。其中UV31、UV32、UV33、UV44 第一代产量都比野生菌高，其中最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍。如表1 所示。本研究中BC 产量范围在26.00 g/L～36.0 0 g/L。赵琼等紫外诱变，得到诱变菌株产量提高1.5 倍，但是产量仅为3.52 g/L[10]；文献[15]综述了近几年为提高BC 进行的研究，从菌种选育到改良，再至发酵优化，BC 的干重为2.00 g/L～13.00 g/L，比与本研究的低，其可能的原因有：1）选用野生株个体存在差异；2）发酵时采用发酵容器不同，木醋杆菌为需氧菌，和氧气的接触面越大越有利于BC 产量的提高；3）发酵培养基不同；4）收获周期不一样等。经比较，本研究中所得菌株较优良，其BC产量也较高，具有开发和应用的潜力。

2.3 诱变菌株续代培养

对以上优良菌株进行续代培养，产量结果如表2所示。

表2 续代发酵细菌纤维产量Table 2 The BC yield of continued generations g/L

其中诱变菌株UV31、UV32、UV33 连续生产四代产量分别稳定在23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。菌株UV44 和UV51 分别在第三代和第二、四代出现BC 的产量不稳定，因此没有进一步的考虑这两个菌株的生产情况。赵琼等的研究表明菌株C544续代发酵产量同样稳定，只是产量仅在3.49 g/L～3.60 g/L 之间[10]，其产量比本研究的低，表明所得的紫外诱变菌株是稳定的。

2.4 3 种培养基发酵得到BC 的形态及产量比较

用MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 种培养基培养野生菌、UV32、UV42 菌株，分析比较3 组BC 的厚度、颜色、质地及干重，结果如图2、表3 所示。

图2 UV33 菌株在3 种培养基中发酵的BC 形态Fig.2 The form of the BC fermented by UV32 strain in three different kinds of medium

表3 3 种不同培养基发酵产生的BC 的形态及产量对比Table 3 Contrast of form and yield of the BC fermented by three different kinds of medium

CMMF 培养BC 产量最高，为19.94 g/L～39.97 g/L，形态饱满，即持水性好，手感柔软，但不结实易穿透；CO-MMF-CMMF 培养BC 产量一般，为16.24 g/L～31.09 g/L，各特性比较接近CMMF 培养得到的BC；MMF 培养BC 产量最少，为10.17 g/L～22.28 g/L，但最结实不易穿透，即机械性能最好。三者的颜色也有差异，如图2 所示。本研究验证了BC 生物合成具有可调控性，培养方法和培养条件的不同均可影响其合成与结构[3]。故可选取不同培养基进行发酵，生产出不同特性的BC。

3 结论

本研究表明对木醋杆菌野生菌进行紫外诱变能有效地得到高产的菌株，且紫外诱变时间在3 min～4 min 为效果最佳；经筛选得到UV31、UV32、UV33、UV42、UV44 五株产量高的突变菌株，其中产量最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍；菌株UV31、UV32、UV33、UV42 连续发酵四代产量稳定，分别为23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。CMMF 培养能得到高产量BC，为19.94 g/L～39.97 g/L，但不结实；MMF培养能得到结实的BC 但产量低，为10.17 g/L～22.28 g/L；CO-MMF-CMMF 培养能得到较结实且产量为16.24 g/L～31.09 g/L 的BC。结果表明，紫外线诱变3 min 菌株的BC 产量有提高且3 代～4 代发酵产量保持稳定，COMMF-CMMF 发酵能得到机械性和产量均适中的BC。

这个研究只涉及到野生菌的诱变、选育以及培养发酵，未涉及到菌株的保存。由于木醋杆菌的性状极其不稳定，容易受保存条件及保存的时间影响，所以木醋杆菌的保存非常重要。因此希望在选出优良菌种后，能对菌株的保存条件进行深入研究，以便能更好地生产BC，更好地应用于各个领域，造福人类。

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