蛋白质结构在挤压过程中的变化

房岩强 魏益民 张 波

（中国农业科学院农产品加工研究所农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）

蛋白质的螺杆挤压过程通常被认为是蛋白质四级结构、三级结构和二级结构变化的结果［1］。在机械能和热能的作用下，蛋白质分子维持高级结构的非共价键被破坏，分子逐渐展开呈链状结构，并顺着物料运动方向取向［1－3］。在取向过程中，蛋白质分子与蛋白质分子或其他分子之间再随机发生各种化学作用。化学作用主要可能发生在分子侧链之间，其结果是形成网状结构，并呈现出各向异性，即在平行于运动方向的强度较大，而垂直于运动方向的强度较弱［4－6］。由于体系中蛋白质分子较多，因此蛋白质分子间作用形成的聚合体可能是骨架，其他分子则填充在骨架之间［7］。

研究和明确螺杆挤压过程中蛋白质分子结构的变化，可为控制挤压过程中蛋白质的变性提供理论依据，从而有利于改进挤压组织化蛋白产品的生产工艺和提高产品质量。另外，通过挤压过程中蛋白质分子结构变化的研究对于阐明挤压组织化蛋白产品的形成机理具有指导意义。本文从蛋白质组分、分子质量、共价键以及二级结构等方面总结了蛋白质结构在螺杆挤压过程中的变化。

1 蛋白质的组分及分子质量的变化

植物蛋白，如大豆蛋白、小麦蛋白、花生蛋白等是挤压组织化蛋白生产的主要原料。植物蛋白依据其溶解性，可分为清蛋白（albumin）、球蛋白（globulin）、醇溶蛋白（prolamin）、谷蛋白（glutenin）和残渣蛋白（residue）［8］。挤压过程中，蛋白质分子变性，溶解性等理化特性发生变化，表现出蛋白质组分比例的变化。对于挤压后蛋白质组分及分子质量的变化，研究者一方面比较关注挤出蛋白的组分及分子质量分布；另一方面，研究者比较关注的是不同蛋白质组分与挤压产品网状结构形成的关系。

不同挤压原料，5种蛋白质组分含量有所不同，如小麦蛋白主要以谷蛋白和醇溶蛋白为主，而大豆蛋白主要以球蛋白为主。目前，大多数研究表明，挤压后，原料中的主要蛋白质组分含量显著降低，而残渣蛋白含量显著增加。Gujska等［9］采用Osborne的蛋白质组分提取方法，对不同温度（110、135、150℃）挤压后的菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量进行了研究，结果表明，各种温度挤压处理后，菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量都显著降低，而残渣蛋白含量均显著增加。挤压后菜豆中的清蛋白和球蛋白分别降低了59%～84%和70%～93%，而残渣蛋白增加了221%～288%。斑豆中的清蛋白和球蛋白分别降低了77%～80%和92%～94%，而残渣蛋白增加了253%～264%。Alonso等［10］对挤压前后豌豆和四季豆中清蛋白和球蛋白的含量进行了类似研究，结果表明，挤压后豌豆中的清蛋白和球蛋白分别降低了41%和78%，而残渣蛋白增加了226%。四季豆中的清蛋白和球蛋白分别降低了64%和85%，而残渣蛋白增加了224%。Li等［11］通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对小麦蛋白挤压前后的组分分布进行了研究，结果表明，挤压后麦谷蛋白和麦醇溶蛋白含量显著降低，残渣蛋白显著增加。

挤压过程中，蛋白质组分的变化与不同组分氨基酸的组成有较为密切的关系。清蛋白和球蛋白大多是生理活性蛋白质，含较多的赖氨酸、色氨酸和蛋氨酸；醇溶性蛋白和谷蛋白是贮藏性蛋白，脯氨酸和谷氨酰胺含量较高，赖氨酸、色氨酸和蛋氨酸含量较低。Li等［11］发现，小麦蛋白挤压过程中，分子质量位于45～66 ku的麦醇溶蛋白受高温挤压影响较小，认为可能是由于这部分麦醇溶蛋白所含疏水性氨基酸或半胱氨酸较少，挤压过程中，它们不能通过疏水作用或二硫键发生聚合。Fischer［12］对小麦蛋白挤出物研究后也有类似发现。Fischer的结果表明，麦醇溶蛋白与蛋白质网的形成高度相关，但不同种类麦醇溶蛋白与其的密切程度不同。挤压产品网状结构的形成主要与α－麦醇溶蛋白和γ－麦醇溶蛋白有关，与ω－麦醇溶蛋白关系较小。这是由于ω－麦醇溶蛋白缺少巯基基团，不能通过二硫键发生聚合。但Fischer又认为ω－麦醇溶蛋白仍可能通过非二硫键的聚合对蛋白质网络形成发挥一定作用。

螺杆挤压过程中，分子质量变化是导致蛋白质理化特性改变的重要原因，例如分子质量或分子尺寸的增加往往导致蛋白质溶解性的降低［11］。挤压过程中既有蛋白质的降解，又有蛋白质的聚合［12－14］，因此，蛋白质分子质量的变化较为复杂。对于挤压过程中蛋白质分子质量变化的研究，目前多采用聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳法，考察蛋白质亚基分子质量分布的变化。对于蛋白质真实分子质量变化的研究还很有限［15］。

Alonso等［10］通过 SDS－PAGE对豌豆和腰豆挤压前后的蛋白质片段进行了分析。结果表明，挤压后，豌豆原有的 75、50、38、25、22 ku的电泳条带变得模糊，而新出现了34、14 ku的蛋白片段；腰豆原有的45、31 ku的电泳条带消失，新生成了分子质量为14～22 ku的蛋白片段［6］。Chiang［16］通过 SDS－PAGE对大豆挤压前后的蛋白质片段进行了分析。结果表明，挤压后大豆原有的42 ku的7S球蛋白亚基消失，而34～44 ku11S球蛋白亚基的含量显著增加。陈锋亮［17］对大豆蛋白挤出物的亚基条带分析后，发现大豆蛋白 7S／11S的亚基比例显著降低。Anderson等［13］通过SDS－PAGE对小麦蛋白挤压前后的蛋白质片段进行了分析。结果表明，挤压后蛋白质的亚基分布呈现出由高分子质量向低分子质量转变的趋势。徐树来［18］通过SDS－PAGE对米糠蛋白挤压前后的蛋白质片段进行了分析。结果表明，挤压后米糠蛋白质的分子质量整体降低。

挤压后，原料中的主要蛋白质组分含量显著降低，残渣蛋白含量显著增加。但挤压处理对ω－麦醇溶蛋白等不含硫氨基酸片段影响较小。挤压后，蛋白质的亚基分子质量分布呈现出向小分子质量转变的趋势，这可能是由于蛋白质分子受到高温和剪切力的作用后，各亚基产生分离引起的［19］。

2 蛋白质共价键的变化

螺杆挤压破坏了蛋白质分子与蛋白质分子或其他分子之间旧的化学键和相互作用，并通过形成新的化学交联，使得肉类似物得以形成。肽键和二硫键是蛋白质结构维持中的主要共价键。它们也是挤压过程中蛋白质分子作用力变化的重要研究对象。

挤压过程中是否有异肽键的形成，即维持挤压产品结构的作用力中是否有异肽键一直是研究者争议的焦点。Burgess等［20］认为，挤压过程中，大豆蛋白分子间有新的肽键（异肽键）形成，新形成的异肽键是维持挤压产品结构的最主要化学键，而二硫键的作用可以忽略。Hager［21］以大豆浓缩蛋白为原料，对维持组织化产品化学作用力的主要类型进行了分析。结果表明，挤压过程中没有异肽键的生成，疏水作用、氢键和分子间二硫键是维持挤压产品结构的三种主要化学作用。这与Burgess等的结论截然相反。Hager认为，这可能是由于挤压温度不同所致。Burgess等采用的挤压温度为150～190℃，而Hager采用的最高温度仅有150℃。后来，Prudêncio－Ferreira等［22］系统研究了挤压温度（140～180℃）对蛋白质分子作用力的影响。结果表明，二硫键和非共价键作用是维持挤压产品结构的主要作用力，即使180℃条件下挤压后，维持组织化产品的作用力中也没有异肽键。当前大多数研究表明，组织化产品网状结构的维持主要通过二硫键和非共价键作用，而没有异肽键的参与［23－26］。

自由巯基和二硫键含量变化的研究是探讨二硫键作用的重要途径。Burgess等［20］对大豆浓缩蛋白挤压前后自由巯基和二硫键含量测定后发现，挤压后大豆蛋白的二硫键浓度由4．5×10－8mol／mg降至0．9×10－8mol／mg，而自由巯基浓度由 3．3×10－8mol／mg升高到 48．9×10－8mol／mg。因此，他们认为挤压会严重破坏二硫键的形成。Hager［21］在水分为27%挤压温度140℃条件下考察了挤压对大豆分离蛋白自由巯基和二硫键含量的影响。结果表明，挤压后大豆蛋白的二硫键浓度由22．7×10－8mol／mg降至19．6×10－8mol／mg，而自由巯基浓度由 0．5×10－8mol／mg升高到4．1×10－8mol／mg。当前，大部分研究结果与他们的研究基本一致。即挤压处理对二硫键有破坏作用，并引起自由巯基含量的增加［11，13，22］。

挤压温度是影响蛋白质自由巯基和二硫键含量的重要因素［22，27－28］。Prudêncio－Ferreira等［22］分别对140、160、180℃挤压处理后大豆分离蛋白挤出物中自由巯基和二硫键的含量进行了测定。结果表明，140℃挤出物中的二硫键含量与原料相比基本没有变化（增加了0．2%），160、180℃挤出物中二硫键的含量相比原料分别降低了17%和25%；自由巯基含量在各温度处理后相比原料都有显著增加，分别增加了42%、76%和 122%。Fischer［12］分别对 140、160、180℃挤压处理后小麦蛋白挤出物中自由巯基的含量进行了测定。结果表明，自由巯基含量在各温度处理后都有显著增加，分别增加了107%、113%和348%。Rebello等［29］分别对160、185℃小麦蛋白挤出物中的二硫键含量进行了测定。结果表明，挤压温度对小麦蛋白挤出物中的二硫键含量具有负影响。张汆［27］分别对 100、120、140、145、150、155℃挤压处理后花生蛋白挤出物中的二硫键含量进行了测定。结果表明，当挤压温度低于150℃时，挤出物中的二硫键含量相比原料基本没有变化，但155℃挤压处理后，挤出物中二硫键含量相比原料显著降低。可见，挤压温度对二硫键含量具有负影响，对自由巯基含量具有正影响，特别是当挤压温度大于160℃时，温度对自由巯基和二硫键含量变化的影响更为明显。

挤压过程中，自由巯基和二硫键含量的变化同时受到水分含量的影响。Prudêncio－Ferreira等［22］发现，当水分由30%升至40%时，大豆分离蛋白挤出物中自由巯基含量由 5．42×10－10mol／mg降低至4．37×10－10mol／mg，二硫键含量由249．9×10－10mol／mg升高至278．0×10－10mol／mg。表明水分含量对二硫键有正影响，对自由巯基有负影响。Fischer［12］以小麦蛋白为原料也进行了水分含量对自由巯基含量影响的研究。结果也表明，水分含量对自由巯基有负影响。当水分由20%升至24%时，挤出物中自由巯基含量由 11．82×10－9mol／mg降低至 4．59×10－9mol／mg。

挤压过程中，机械剪切也是影响自由巯基和二硫键含量的重要因素。理论上分析，机械剪切对二硫键的形成具有相反的两方面作用。一方面，机械剪切可以导致蛋白质分子更多的巯基基团暴露；在氧气的参与下，巯基基团发生氧化反应，从而促进二硫键的形成。另一方面，机械剪切凭借物理剪切作用，打断蛋白质分子之间的二硫键，降低二硫键的含量［30－31］。因此，机械剪切对自由巯基和二硫键含量的影响会因机械剪切强度的不同而产生差异。Fischer［12］发现，当单位机械能耗（SME）由 32．1 Wh／kg升至41．1 Wh／kg时，小麦蛋白挤出物中自由巯基含量由 20．54×10－9mol／mg降 低 至 8．68×10－9mol／mg。Rebello等［29］发现，当 SME由 302 kJ／kg升至656 kJ／kg时，小麦蛋白挤出物中自由巯基含量由7．7×10－9mol／mg升高至 21．6×10－9mol／mg，而二硫键浓度由51．5×10－9mol／mg降低至 43．1×10－9mol／mg。

挤压过程中没有异肽键产生。挤压过程中，挤压温度、水分含量和机械剪切强度对二硫键的形成都具有重要影响。挤压温度对二硫键含量具有负影响，对自由巯基含量具有正影响；当挤压温度大于160℃时，自由巯基和二硫键含量的变化更显著。水分含量对二硫键含量有正影响，对自由巯基含量有负影响。

3 蛋白质二级结构的变化

蛋白质的二级结构是指多肽链借助氢键作用排列成为沿一个方向、具有周期性结构的构象，以α－螺旋、β－折叠、β－转角和无规则卷曲最为常见［32］。挤压过程中，蛋白质分子去折叠化，相对线性化，蛋白质的二级结构遭到破坏。其研究焦点在于挤压后蛋白质的有序二级结构是否完全丧失，即破坏的程度。

Yuryev等［33］较早通过红外光谱技术对大豆分离蛋白挤出物构象进行了观察。结果表明，挤压后，蛋白质 β－折叠结构含量增加。Prudêncio－Ferreira等［22］对不同温度（140、160、180℃）和水分含量（30%和40%）条件下大豆分离蛋白挤出物进行了红外光谱分析。结果表明，所有挤出物中都含有β－折叠结构。魏益民等［19］以低温脱脂豆粕为原料，分别对120、140、160℃条件下大豆蛋白挤出物的二级结构变化进行了红外光谱分析。结果也表明，挤压后，大豆蛋白没有完全线性化，或完全转变为无规则卷曲结构，一定的有序结构（β－折叠和β－转角）仍被保留。但 Qi等［34］以圆二色光谱对不同温度（50、75、100℃）和水分条件（20%～50%）下乳清分离蛋白挤出物的二级结构研究后发现，50℃的挤出物与原料相比，二级结构基本没有变化；当温度升至75℃，蛋白质有序二级结构的含量开始显著降低；当温度达100℃时，蛋白质已只剩下无规则卷曲结构；表明挤压温度对蛋白质的二级结构影响显著。有研究同时发现不同水分条件下所得挤出物的二级结构基本没有变化，表明水分含量对蛋白质的二级结构影响较小［20］。陈锋亮［17］以红外光谱对不同挤压温度（140、150、160℃）和含水量（28%～60%）条件下大豆分离蛋白挤出物的二级结构研究后也有类似发现，即挤压温度对α－螺旋和β－转角的含量具有显著的负影响，对β－折叠的含量具有显著的正影响，而对无规则卷曲结构的含量没有显著影响。物料水分对蛋白质各二级结构的变化影响较小。但物料水分与挤压温度存在显著的交互作用，并对β－转角的含量产生极显著负影响。

挤压过程中，机械剪切对蛋白质的二级结构也有一定影响。魏益民等［19］以低温脱脂豆粕为原料，系统研究了螺杆转速对蛋白质二级结构的影响。结果表明，当螺杆转速由60 r／min升高至180 r／min时，大豆蛋白β－折叠质量分数由55．6%降低至46．7%，而β－转角质量分数由44．4%升高至53．5%。

可见，挤压过程中蛋白质二级结构的变化受挤压温度影响较大。当温度高于某一临界值时，蛋白质的有序二级结构开始完全丧失。此临界值的高低因挤压原料的不同而存在较大差异。对于植物蛋白，此临界温度高于180℃。水分含量对二级结构的变化没有显著影响。螺杆转速对β－折叠具有负影响，而对β－转角具有正影响。

4 结论

螺杆挤压后，原料中的主要蛋白质组分含量显著降低，残渣蛋白含量显著增加。挤压后，蛋白质亚基的分子质量分布呈现出向小分子质量转变的趋势。

挤压过程中没有异肽键的形成。挤压温度对二硫键含量具有负影响，对自由巯基含量具有正影响。当挤压温度大于160℃时，温度对自由巯基和二硫键含量的影响更明显。水分含量对二硫键含量有正影响，对自由巯基含量有负影响。

挤压会导致蛋白质的α－螺旋、β－转角等有序二级结构含量降低。当挤压温度低于180℃时，植物蛋白不会完全转变为无规则卷曲结构。水分含量对蛋白质二级结构的变化没有显著影响。螺杆转速对β－折叠具有负影响，对β－转角具有正影响。

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