细菌非编码小RNA的分类及功能简介

聂佳佳，金 鑫，孟宪臣，朱国强

（扬州大学兽医学院，扬州 225009）

长期以来，RNA一直被人们误解，认为仅是DNA和蛋白质之间的“中介”，是遗传信息的“过渡”，它从DNA获得遗传信息再把它转译成蛋白质，从而确保了遗传信息的稳定。直到1967年，通过对大肠杆菌体内所有的RNA进行标记，在聚丙烯酰胺凝胶上探测到一种数量较多的新RNA分子，并将其命名为sRNA-6S RNA[1]，人们才窥探到sRNA世界的冰山一角。近年来，随着生物信息学、cDNA文库及分子克隆等技术的发展，在原核生物体内越来越多的小分子RNA被发现，我们才真正领略到了小分子RNA的无限魅力。

细菌非编码小 RNA (Non-coding，small RNA，简称sRNA）是一类长度为40～500个核苷酸，在基因组中被转录但是不编码蛋白质的一类RNA分子[2]，转录通常开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，终止于一个Rho不依赖的转录终止子，茎环结构有助于稳定整个分子, 因此大多数sRNA明显比mRNA稳定。sRNA在感应外界环境变化，控制基因表达中发挥十分重要的作用。大多数sRNA位于2个蛋白编码基因之间的非编码区，即阅读框（open reading frame，ORF）之间。还有一些 sRNA 是从mRNA的5'或3'非转译区域剪切下来的。sRNA广泛存在于各种细菌染色体上，少部分存在于质粒、噬菌体或转座子上[3]。

1 sRNA的作用机制以及分类

现已证明几乎所有的生物体均含有sRNA分子。但细菌中sRNA分子的生物学功能大多尚未阐明。就目前已鉴定的sRNA，根据其生物学功能以及作用机制可分为3大类:

1.1 具有特殊活性的sRNA行使持家功能的sRNAs，它们高度表达并且是必需的。目前发现此类细菌sRNA有三种，包括具有酶催化活性并形成RNase P的催化亚单位M1RNA、转移信使RNA（transfer messenger RNA，tmRNA 或 10SaRNA）[4]以及组成核糖核蛋白（ribonueleoprotein，RNP）复合物 4.5S RNA。

1.1.1 M1 RNA M1 RNA 是一种具有特殊功能的sRNA，是RNase P（一种关键的RNA加工酶，对细胞存活是必需的)的催化亚单位，长377个核苷酸，由初始转录物经RNase E在3'端加工而成。RNase P具有内切酶活性，能够对tRNA前体的5'端进行剪切形成成熟的tRNA。

1.1.2 tmRNA tmRNA 同时具有 tRNA 和 mRNA 的性质，又称10saRNA，长363 nt，是迄今为止发现的唯一、且在所有细菌中均存在的sRNA。它在体外可以被丙氨酰tRNA合成酶氨酰化，说明tmRNA具有类似tRNA结构。但tmRNA没有反密码子的茎环结构，比tRNA大得多。同时，tmRNA分子含有一个开放阅读框，可以编码长度为8～35个氨基酸残基的羧基端标记序列，说明它还具有mRNA的特性。正因为如此，在反式转译反应中，tmRNA分子在小分子蛋白SmpB的参与下，起到tRNA和mRNA的双重功能作用，丙氨酰-tmRNA识别由于mRNA 缺乏终止密码子而停滞在mRNA 3'端停滞的核糖体，并进入A位；新生肽转移至tmRNA的丙氨酰基上，核糖体则转位至tmRNA编码的标记序列的阅读框结构上，生成由缺少终止密码子的mRNA编码的多肽，该多肽羧基末端加上了标记序列。而带有该标记序列的多肽则成为了蛋白质水解酶的目标。停滞的核糖体在标记序列ORF的终止密码处脱落，能够进入到新蛋白质合成中去，从而减少由于停滞的核糖体和不完整的蛋白质对细胞产生的损伤[5]。

1.1.3 4.5S RNA 4.5S RNA 在蛋白质分泌过程中作为信号识别颗粒（SRP）的一个必需组分起作用。长114 nt，由前体分子经 RNase P 5'端加工而来。在细胞中，编码4.5S RNA的基因是必需的，常与核糖体相结合而在转译过程中起作用，与SRP及其受体（FtsY蛋白）一起介导蛋白质靶向内质网或细菌质膜的运输。缺乏该基因会抑制蛋白质合成[6]。

1.2 与蛋白质相互作用而影响蛋白质功能的sRNA这类sRNA主要通过与蛋白质相互作用从而影响这些蛋白质的生物学功能，本文着重介绍以下两个sRNA:6S RNA是除了rRNA和tRNA外大肠杆菌中已测定序列的第一个RNA分子[7]，为一个双顺反子mRNA的一部分转录而来的。长度为184 nt，在原核生物中高度保守并且在稳定期逐渐积聚, 它能够与σ70- RNA聚合酶相互作用并改变它对启动子识别的特异性[8]。PspF 基因是高pH条件下细菌生存所必需的，序列分析显示其-10 bp上游含有TGn序列，是6S RNA作用的靶 mRNA[9-11]。6S RNA能够与s70-RNA聚合酶全酶结合改变RNA聚合酶的活性，从而抑制启动子区域-10 bp上游含TGn序列（TGnTATAAT）基因的转录。6S RNA可能的作用是稳态期均衡营养的需求，降低应激条件的应答以储存能量[7,12]。

CsrB RNA和CsrC RNA能够与全局转录后调控因子CsrA蛋白相互作用形成一个调控反应回路。在这个回路中，这2个RNA分子作为CsrA蛋白的拮抗物，严紧地调控着该蛋白的活性。CsrA是由61个氨基酸残基组成的小分子转译调控蛋白，通过与glgC (糖原代谢)基因转录物的核糖体结合位点周围的序列结合抑制转译的起始。大肠杆菌中sRNA分子CsrB全长369 nt，有22个与CsrA结合位点一致的序列，可通过与CsrA结合抑制CsrA的功能。CsrC也通过相同的方式作为CsrA蛋白的拮抗物发挥调节功能[13]。

1.3 与目的mRNA配对结合调控基因表达的sRNA这是细菌sRNA发挥调节功能最为普遍的一种形式，目前发现的细菌sRNA中绝大多数都属于这个类型。sRNAs同靶位mRNA结合后，要么抑制或促进靶标mRNA的转译，要么加速或减缓靶标mRNA的降解，而且它们大部分都依赖于和RNA伴侣Hfq的结合发挥作用。

1.3.1 sRNAs与目标mRNA通过不完全的碱基配对结合后，影响RNA酶对靶mRNA的作用，对基因表达进行调节 例如，sRNA分子RyhB对靶基因sodB、sdhC、fumA等的调节。RyhB全长90 nt，主要作为转录后抑制子影响mRNA的稳定性，从而对铁的代谢进行调节。RyhB的表达受Fur蛋白抑制。研究发现Fur蛋白通过负调控RyhB来间接调控细菌内储铁蛋白基因(bfr)和细胞内那些含铁的非必需元件基因(sodB、sdhC、fumA)的表达。当细胞内铁缺乏时，Fur蛋白失活，RyhB表达水平升高,与sodB、sdhC、fumA和bfr等基因的mRNA配对后，通过与RNase E形成降解复合体对这些基因的mRNA进行降解[18]，从而减少铁的储存和消耗[14]。

同时，sRNA除了通过碱基配对促进靶标mRNA降解之外，有些细菌sRNA可以结合在靶标mRNA的3'端，起到稳定靶标mRNA的作用。

1.3.2 sRNA调节子与靶mRNA互补配对后，也可通过影响靶mRNA与核糖体结合，对目的基因表达进行调节 例如，Spot42和OxyS能够封闭靶mRNA的核糖体结合位点抑制靶基因的表达，DsrA和RprA与靶RNA配对结合后则可暴露其核糖体结合位点促进目的基因转译。

sRNA Spot42 全长 109 nt，能够对 gal操纵子进行调节，从而使UDP-半乳糖差向异构酶（由galE基因编码）和半乳糖激酶（由galK基因编码）的比例发生改变，以适应不同的生存环境。这个sRNA可与galE mRNA的一些序列配对，而这些序列与galK基因的核糖体结合位点相互重叠，从而阻断galk的转译，而galE的表达未受影响, 因此使得galK编码的半乳糖激酶和由galE编码的UDP-半乳糖-4-差向异构酶水平发生改变以应对不同的生存状态[15]。

OxyS对转录激活因子fhlA的调节也是通过与fhlA的mRNA配对结合，封闭核糖体结合位点，阻止核糖体与fhlA的结合，阻止核糖体与fhlA的结合，抑制fhlA的转译而实现[16]。

sRNA与靶mRNA结合后也能释放核糖体结合位点从而激活基因的表达。正常细胞状态下，rpoS基因5'端非转译区以折叠的形式存在，掩盖了核糖体结合位点，使其转译处于关闭状态。饥饿、渗透压等条件下，DsrA和RprA与rpoS的mRNA 5'端UTR配对结合，释放SD序列，暴露核糖体结合位点，促进rpoS蛋白的转译，增加大肠杆菌对不利环境的适应性[17]。

1.3.3 RNA 分子伴侣蛋白 Hfq sRNA 与靶 mRNA 的配对大多需要Hfq的参与。Hfq分子量为11.2 kDa，最初是作为大肠杆菌RNA噬菌体Q复制所需要的宿主因子而被发现[18]。进一步研究表明Hfq与真核细胞和古细菌细胞体内的剪切体，mRNA降解复合体中的核心蛋白Sm和Sm样蛋白同源[19]。

Hfq由一个a螺旋和5个β折叠形成同源六聚体，能够与单链RNA中富含A、U的序列结合，增加sRNA的稳定性。Hfq参与sRNA转录后水平调控的机制还不清楚。目前有两种推测。第一种是Hfq与sRNA结合后，改变sRNA的结构，暴露出与靶mRNA配对的序列，与靶mRNA形成sRNA-mRNA 稳定结构，Hfq本身的结构并不改变。另一种则是Hfq同时使sRNA和mRNA的局部浓度升高，利于sRNA-mRNA复合物的形成[20]。

2 sRNA作用

sRNA对细菌的生长、繁殖具有重要的调节作用，它们的主要功能是感应环境的变化，调控细胞的代谢途经、生长方式使之与环境相适应，以及控制细菌毒力基因的表达。因此，sRNA与细菌适应外界环境、营养代谢以及毒力基因表达有着密切关系。以下将对sRNA在调控细菌的铁代谢、群体感应及生物膜形成、适应环境变化以及调控毒力基因的表达等过程中的相关功能进一步详述。

2.1 细菌sRNA与铁离子sRNA能迅速关闭许多蛋白质的合成, 改变细胞必需营养物。其中，铁离子就是典型的例子。铁是细菌生命活动必需的营养元素之一，但浓度过高会对细菌产生毒害作用，因此，大多数细菌利用铁吸收调节蛋白（Fur）调控铁的吸收、转运和利用。最近研究表明，细菌中某些sRNA可调节铁代谢过程中多个基因的表达，其中研究最深入的是大肠杆菌中受Fur调控的sRNA RyhB，RyhB是细菌感受到环境中铁离子浓度下降时表达的一种sRNA，它可以下调多种靶标。当环境中铁浓度过高时，Fur蛋白与铁结合，处于这种构象的Fur蛋白能够结合RyhB基因，并阻止其转录，从而使细菌铁储存蛋白和非必需的铁硫蛋白基因（如超氧化物歧化酶基因sodB，sdhCDAB操纵子等）大量表达，铁离子被迅速利用，细胞内铁浓度维持正常水平[21,22]。当环境铁浓度较低时，Fur蛋白失去铁原子发生构象改变，不再能够与RyhB基因结合，失去了对RyhB基因转录的阻遏作用，于是RyhB得以表达。RyhB通过与铁储存蛋白和非必需的铁硫蛋白mRNA部分序列的碱基配对，降低其mRNA稳定性和转译效率，使其表达受抑制，从而减少铁的储存和消耗[23]，让更多的铁能够被节省下来用于细菌最基本的生理需求。

2.2 调控细菌群体感应和生物膜形成在细菌生长过程中，能够释放特定信号分子，使细菌可以感知周边环境中的同类数量，以此来调节自身多种基因的表达，这种现象称为群体感应（quorum sensing，QS），而这类信号分子称为自体诱导子（autoinducer，AI）。这是一种对细菌群体的基因表达调控, 也是一种细菌细胞间的通讯方式。AI拥有可以自由进出细胞膜的性质，因此，随着细菌在一个封闭环境中的细胞数目不断增加，细胞外的信号分子，即AI分子的浓度也不断提高；当AI浓度达到一定阈值时，某些特异性基因的表达被启动，在许多QS系统中，这种基因的启动是由多种sRNA决定的[24]。

2.3 细菌sRNA感知环境因素变化并调控毒力基因的表达细菌sRNA的功能与细菌适应环境变化有着直接的关系[12]，其功能主要是感受生存条件的改变而调整细菌的基因表达， 使之适应环境的变化；当然细菌毒力和细菌生活环境是相关的，因此，sRNA对细菌的毒力也有巨大的影响[25]。当细菌进入宿主体内，细菌感受到环境的改变，从而调整自身毒力基因的表达，最有效地促进细菌的生长、繁殖和扩散。多数情况下，细菌进入机体后，环境非常适合于细菌的生长，因此细菌会大量表达毒力基因，这些毒力基因产生的蛋白破坏宿主的正常生理状态，从而使环境更加有利于细菌的生存。一个细菌sRNA通过调节一组相关基因的表达，启动细菌细胞内部的相关机制，导致细菌对环境的变化做出最恰当的反应。

细菌sRNA的转录受到严格的调控，这些调控因子大多是环境因素。每种环境因素至少和某一种sRNA相关，该sRNA可以将环境改变信号传导到细菌胞内有关基因，并引起一系列的反应。例如低温、营养缺乏或者应激等恶劣条件均可导致不同的sRNA（如DsrA、RprA等）表达[26]，这些sRNA都能激活RpoS基因，RpoS蛋白是细菌RNA聚合酶的一个特别的亚基（σ因子），具有识别特定启动子的能力，RpoS基因的激活可以启动一系列下游基因的表达，使细菌生长适应恶劣的环境，进入稳定生长期（降低繁殖速度）。

总而言之，细菌sRNA在感知环境变化，进而调控相关基因表达，适应并改造环境的过程中起着至关重要的作用。

3 展望

sRNA作为原核生物中新发现的一类基因表达调控因子，通过感应外界环境条件，在转录后水平调节基因的表达，目前已成为国际上新的研究热点。虽然已分离的sRNA种类较多并不断被人们认知，但大多数sRNA功能未知，其作用机制及其调控网络研究仍然处于初级阶段。从目前积累的知识分析，原核生物可能借助于这些sRNA对它们的生理系统进行精细调控，以便适应迅速变化的环境。因此，深入认识这些sRNA可能开辟一个新的研究领域。

[1]Hindley J.Fractionation of 32 P labelled ribonucleic acids on polyacrylamidegels and their characterization by fing erprinting [ J].J MolBiol, 1967, 30( 1)： 125-136.

[2]Wassarman K M, Zhang A, Storz G.Small RNAs in Escherichia coli [J].Trends Microbiol, 1999, 7(1)： 37-45.

[3]Livny J, Waldor M K.Identification of small RNAs in diverse bacterial species[J].Curr Opin microbial, 2007,10(2)： 96-101.

[4]Mikulik K, Paleckova P, Felsberg J,et al.SsrA genes of streptomycetes and association of proteins to the tmRNA during development and cellular differentiation.Proteomics, 2008, 8(7)： 1429-1441.

[5]徐丰 , 金由辛 .大肠杆菌中的小分子 RNA.生命的化学 ,1999, 19(4)： 162-166.

[6]Herskovits A A, Bochkareva E S, Bibi E.New prospects in studying the bacterial signal recognition particle pathway.Mol Microbiol, 2000, 38(5)： 927-939

[7]Wassarman K M.6S RNA： a small RNA regulator of transcription.Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2)： 164-168.

[8]Lee C A, Fournier M J, Beckwith J.Escherichia coli 6S RNA is not essential for growth or protein secretion.J Bacteriol, 1985, 161(3)： 1156-1161.

[9]Wassarman K M, Storz G.6S RNA regulates Escherichia coli RNA polymerase activity.Cell, 2000, 101(6)： 613-623.

[10]Willkomm D K, Hartmann R K.6S RNA： an ancient regulator of bacterial RNA polymerase rediscovered.Biol Chem, 2005, 386(12)： 1273-1277.

[11]Trotochaud A E, Wassarman K M.A highly conserved 6S RNA structure is required for regulation of transcription.Nat Struct Mol Biol, 2005, 12(4)： 313-319.

[12]Storz G, Altuvia S, Wassarman K M,et al.An abundance of RNA regulators.Annu Rev Biochem, 2005, 74(10)：199-217.

[13]Kulkarni P R, Cui X, Williams J W,et al.Prediction of CsrA regulating small RNAs in bacteria and their experimental verification in Vibriofischeri.Nucleic Acids Res, 2006, 34(11)： 3361-3369.

[14]Arlu ison V, Mura C, Guzman M R,et al.Th reedimensional Structures of Fibrillar Smproteins： Hfq and Other Sm-like Proteins[ J].J Mol Biol, 2006, 356 (1)：86-96.

[15]Moller T, Franch T, Udesen C,et al.Spot42 RNA mediates discoordinate expression of the E.coli galactose operon[ J].Genes Dev, 2002, 16 (13)： 1696-1706.

[16]Argaman L, Altuvia S.fhlA repression by OxyS RNA：kissing complex formation at two sites results in a stable antisensetarget RNA complex.J Mol Biol, 2000, 300(5)：1101-1112.

[17]Liu J M, Bittker J A, Lonshteyn M,et al.Functional dissection of sRNA translational regulators by nonhomologous random recombination and in vivo selection.Chem Biol, 2005, 12(7)： 757-767.

[18]Zhang A, Wassarman K M, Or tega J,et al.The Sm.like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs[ J].Mol Cell, 2002, 9( 1) ： 11-22

[19]Sauter C, Basquin J, Suck D,et al.Sm-like proteins in eubacteria： the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli.Nucleic Acids Res, 2003, 31(14)： 4091-4098.

[20]Brennan R G, Link T M.Hfq structure, function and ligand binding.Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2)： 125-133.

[21]Masse E, Vanderpool C K, Gottesman S.Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli [ J].J Bacteriol, 2005, 187(20)： 6962-6971.

[22]Jacques J F, Jang S, Prevost K,et al.RyhB small RNAmodulates the free intracellular ironpool and isesstial for normal growth during iron limitation in Escherichia coli [ J].Mol Microbiol, 2006, 62(4)：1181-1190.

[23]Masse E, Escorcia F E, Gottesman S,et al.Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli.Genes Dev, 2003, 17(19)：2374-2383.

[24]Lenz D H, Mok K C, Lilley B N,et al.The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing inVibrio harveyi and Vibrio cholerae [J].Cell,2004, 118(1)： 69-82.

[25]Sittka A, Pfeiffer V, Tedin K,et al.The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium.Mol Microbiol, 2007, 63(1)： 193-217.

[26]Repoila F, Gottesman S.Temperature sensing by the dsrA promoter.Bacteriol, 2003, 185(22)： 6609-6614.