副黏病毒V蛋白阻断干扰素信号通路的分子机制研究进展

傅 强，仇旭升，陈素娟，彭大新，丁 铲

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.扬州大学兽医学院，扬州225009）

副黏病毒科（Paramyxoviridae）包括了很多重要的、广泛存在的对人和动物致病的病毒，包括麻疹病毒（Measles virus)，呼吸道合胞体病毒（Human respiratory syncytial virus）， 仙 台 病 毒（Sendai virus）， 腮 腺 炎 病 毒（Mumps virus），亨德拉病毒（Hendra virus），尼帕病毒（Nipah virus）以及对畜牧业生产有巨大影响的新城疫病毒（Newcastle disease virus）和牛瘟病毒（Rinderpest virus）。副黏病毒科分为两个亚科，副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）和肺病毒亚科（Pneumovirinae）。副黏病毒亚科又分为五个属，除了较早划分出来的呼吸道病毒属（Respirovirus），腮腺炎病毒属（Rubulavirus）和麻疹病毒属（Morbillivirus），新增了禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）和亨尼帕病毒属(Henipavirus)[1]。

曾经将新城疫病毒及其他禽副黏病毒划分为腮腺炎病毒，主要因为禽副黏病毒基因组具有腮腺炎病毒科的特征，即缺少C蛋白的阅读框和间隔序列不保守。但是新城疫病毒的P基因及其RNA编辑机制不同于腮腺炎病毒，却与呼吸道病毒属和麻疹病毒属相似。因此，2002年ICTV将所有禽副黏病毒划分为一个新的属——禽腮腺炎病毒属[2]。副黏病毒为单链负股RNA病毒，编码的病毒蛋白包括囊膜表面的糖蛋白（fusion glycoprotein，F 和 (haemagglutinin neuraminidase protein，HN，HN）， 核 蛋 白（nucleocapsid protein，NP）， 基质蛋白（matrixprotein， M）以及病毒RNA依赖的RNA聚合酶的亚基蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，L)、磷蛋白（phosphate protein，P）。此外，副黏病毒能够通过RNA编辑机制，由P基因额外编码多种非结构蛋白，一般命名为V蛋白或C蛋白，有的病毒也命名为W，X or Y[3-5]。最新研究表明，这类非结构蛋白，尤其V蛋白，具有很强的干扰素拮抗功能[6]。

干扰素（Interferon, IFN）是一整套能够调节多种生物反应的细胞因子，其调控范围包括免疫调节，先天性抗微生物反应，获得性免疫的增强以及肿瘤抑制等多个方面。动物病毒的感染能够诱导机体IFN的产生，而IFN的表达诱导了机体的抗病毒作用。甚至，病毒在进入宿主细胞开始转录之前可能就已经受到了抑制。IFN诱导表达的下游蛋白既能够调节单个细胞抗病毒机制，也参与调节整个机体的免疫机制[7,8]。例如，PKR激酶能够磷酸化蛋白合成起始 因 子 eIF-2 (protein synthesis initiation factor)， 从而下调细胞内mRNA的翻译水平；2'，5' -OAS和RNase L核酶能够识别和降解病毒RNA；Mx蛋白家族的GTPase可能作用于病毒核蛋白，并且能够抑制病毒RNA合成；IFN还诱导NO合成酶（iNOS2）和MHC I类分子和II类分子，这些对于整个机体的抗感染免疫都有着重要的作用[9]。

Ⅰ型IFN诱导的抗病毒蛋白基因的活化与表达是宿主细胞抵抗病毒入侵的第一道防线[10]。尽管IFN信号对病毒有抑制作用，副黏病毒仍然利用一系列非结构蛋白的拮抗干扰素，在IFN系统健全的宿主中复制增殖，甚至导致机体发病或死亡。近期研究的副黏病毒IFN逃避机制揭示了其非结构蛋白直接靶向IFN下游信号转导的STAT元件的独特能力。尽管针对的靶蛋白相似，副黏病毒非结构蛋白对STAT的拮抗机制具有多样性。

1 干扰素信号通路

干扰素家族（IFN）包括Ⅰ型干扰素（IFN-α，IFN-β）和Ⅱ型干扰素（IFN-γ）。Ⅰ型IFN与宿主细胞抑制病毒复制的能力有关，这种抗病毒活性的产生是IFN诱导的细胞基因表达水平改变的结果。细胞在IFN信号的刺激下进入“抗病毒状态”，这是一个多种IFN激活基因被活化，转录mRNA及蛋白合成的过程，而这些IFN激活基因产物的多样性对抑制各种病毒家族的感染具有较大作用。

病毒感染导致的急性反应引起Ⅰ型IFN的快速转录激活，以人源IFN-β基因为典型。IFN是在模式识别受体识别各类病毒复制过程中的中间产物后介导产生的，如MDA-5识别dsRNA以及Toll样受体（TLR）识别病毒DNA等[11]。在受到上述信号刺激后，丝/苏氨酸激酶立即激活效应转录因子:IRF-3（interferon regulatory factor 3）、AP1（ATF2/c-Jun）以及NF-κB。这些因子迅速运动到IFN-β增强子附近，从而募集一系列的能重塑染色质的增强子和使RNA聚合酶Ⅱ转录的转录共激活因子[12]。

新合成的IFN-β是由最先感染的细胞分泌的，随后IFN-β直接结合到邻近细胞表面的I型干扰素受体传递信号。与IFN-β结合后，跨膜受体的细胞质部分被Janus家族酪氨酸激酶磷酸化，募集STAT2与之结合。随后，STAT2被磷酸化，随后募集STAT1，导致其发生酪氨酸磷酸化[13]。两种STAT通过SRC同源2结构域-磷酸酪氨酸相互作用，形成异源二聚体，并与IRF9形成异源三聚复合体-ISGF3（IFN激活基因因子3）后入核[14]。ISGF3在核内迅速蓄积，并结合到IFN-α/β激活基因启动子上保守的IFN激活反应元件（ISRE）序列上，大幅增强IFN调控基因的转录效率。此外，IRF7是ISG的一个靶蛋白，能够与IRF3结合诱导大量的IFN-α基因的表达扩大IFN反应。

图1 干扰素信号通路示意图Fig.1 Schematic of IFN signaling by the JAK-STAT pathway

2 副黏病毒的非结构蛋白

根据RNA编辑原理，额外的鸟嘌呤（G）插入到副黏病毒P蛋白mRNA中的特定序列后引起了阅读框+1或+2位移，从而导致了V等非结构蛋白的表达[15]。由于RNA编辑机制的特性，副黏病毒P和V蛋白的N端相同而C端不同。副黏病毒V蛋白在其C端都含有一段保守的半胱氨酸富集区[15]，称 为 C 端 结 构 域（C-terminal domain of V protein,CTD）。在副黏病毒之间，这段V蛋白的半胱氨酸富集区同源性高达50%，包含7个保守的半胱氨酸残基。这个结构域使V蛋白能够结合两个锌原子，与其他真核生物锌结合蛋白相似。有趣的是，尽管结构相似，目前并没有发现与V蛋白功能相近的真核蛋白，且CTD内半胱氨酸残基之间的氨基酸间隔与所有已知的真核生物锌结合结构域（包括RING，PHD或LIM基序）不同[16]。一般认为，这一区域与副黏病毒的宿主逃避机制相关，但是不同种属的V蛋白表现出明显不同的STAT抑制机制。

2.1 腮腺炎病毒V蛋白 STAT泛素连接酶STAT蛋白通过可逆的翻译后修饰，即磷酸化和去磷酸化反应，循环于静默与活化状态之间[17]。STAT1和STAT2的半衰期一般长达几天[11,18,19]，但是在感染腮腺炎病毒科病毒或是表达腮腺炎病毒V蛋白后，其半衰期大大缩短。在模式病毒感染实验中，当细胞感染猴副流感病毒SV5后，或是转染表达SV5 V蛋白的质粒后，细胞内的STAT蛋白蓄积量大幅下降。其他各种腮腺炎病毒的V蛋白也都具有相似的降解STAT的特性[20]。蛋白酶体的化学抑制剂能够抑制腮腺炎病毒V蛋白对STAT的降解作用[21]。另外，腮腺炎病毒V蛋白的表达能够特异诱导STAT的多聚泛素化。体外实验表明，细菌表达的SV5和HPIV2 V蛋白催化泛素转移的反应需要ATP，泛素活化酶（E1）和泛素偶联酶（E2）。V蛋白这种固有的酶活性与泛素连接酶（E3）的特性相似，但是在体外实验中没有能够复制出这种反应，因为它具有底物依赖性，只发生单个泛素的转运而不是产生一条多聚泛素链[22]。在表达V蛋白的完整细胞中，STAT的多聚泛素化会导致其蛋白酶体依赖的蛋白降解。

2.2 亨尼帕病毒属的病毒V蛋白 STAT在细胞浆大分子复合体中蓄积亨德拉病毒和尼帕病毒的V蛋白也靶向作用于STAT1和STAT2从而拮抗IFN反应。不同的是，亨尼帕病毒属的病毒V蛋白并不能导致STAT降解，而是导致其在细胞浆大分子复合体中蓄积[11]。这种复合体的形成阻断了IFN诱导产生的STAT酪氨酸磷酸化[23]。

除了能够结合STAT1和STAT2，亨尼帕病毒属的病毒V蛋白能够利用染色体区维持蛋白1（CRM1）依赖的核输出信号在胞核胞浆间穿梭。这种穿梭不仅影响了V蛋白的亚细胞分布，同时还改变了STAT1的分布状况。STAT1通常分布于正常细胞的胞浆和胞核内，亨尼帕病毒属的病毒V蛋白的表达可以使STAT1限制在细胞质中不能入核[11,23]。意外的是，尽管亨尼帕病毒属的病毒V蛋白的半胱氨酸富集的CTD氨基酸序列与其他副黏病毒高度同源，但是它与IFN信号抑制的关系不大。

尼帕病毒V蛋白结合STAT1的区域已经确定。尼帕病毒V蛋白只与STAT1结合而不与STAT3结合，而且只与形成STAT1-STAT2异源二聚体的STAT1结合[24]。该结果表明，包含连接结构域和SH2结构域的STAT1片段是亨尼帕病毒属的病毒V蛋白作用的靶位，这两个结构域对于STAT的活化，二聚体的形成以及DNA的结合都很重要。

2.3 麻疹病毒V蛋白抑制STAT的核迁移麻疹病毒，属于麻疹病毒属，编码的V蛋白与腮腺炎病毒和亨尼帕病毒截然不同，氨基酸序列的总的同源性仅为20%。尽管差异很大，麻疹病毒V蛋白也能有效的抑制IFN信号转导，但作用机制与腮腺炎病毒或亨尼帕病毒的V蛋白完全不同[25]。麻疹病毒V蛋白的表达可以有效抑制IFN-α/β和IFN-γ诱导产生的转录信号。麻疹病毒 V蛋白并不降解STAT也不抑制STAT酪氨酸磷酸化，但是可以有效阻碍STAT1和STAT2入核。不同于亨尼帕病毒，麻疹病毒V蛋白不在细胞核和细胞质之间穿梭，因此也就不改变STAT1的分布模式。

麻疹病毒感染的细胞能阻止STAT入核，并且出现细胞STAT蛋白大范围的重新分布。在麻疹病毒感染的细胞中，一部分的STAT1和STAT2被重新分布到胞浆中蓄积[25]。许多病毒都有类似的这种细胞内聚集，包括腮腺炎病毒，其感染细胞中的STAT2浓缩成胞质小体。可以推测，这些小体代表着病毒复制或组装的细胞内位点，可能暗示STAT会在麻疹病毒复制中有所作用。

2.4 呼吸道病毒V蛋白和C蛋白 抑制STAT1和STAT2磷酸化仙台病毒是研究的最多的呼吸道病毒，也具有逃逸宿主IFN反应的机制。和其他副黏病毒一样，仙台病毒具有编码多种蛋白的多顺反子P/V阅读框，通过不同位置的翻译起始位点编码了一套C蛋白（C,C',Y1和Y2）。对V蛋白缺失的重组病毒的研究表明，仙台病毒V蛋白在感染动物后致病中发挥作用，但其确切功能还不得而知。4种仙台病毒C蛋白都能阻断IFN信号。C蛋白IFN逃逸功能的研究已经陆续开展，其多种功能已有文献报道。C蛋白可以结合STAT1，诱导STAT1转移到一种大分子复[11-26]。还有研究报道C蛋白可以抑制STAT1以及STAT2酪氨酸的磷酸化。C蛋白可以延迟STAT1酪氨酸的磷酸化，削弱STAT1的丝氨酸磷酸化。值得注意的是，有些实验结果表明C蛋白可以引起单个泛素的连接以及某些鼠源细胞系STAT1蛋白的降解，而伴随的是STAT1酪氨酸磷酸化水平升高[27,28]。C蛋白影响IFN反应的机制基础有待深入研究，以阐明其在宿主逃避机制中的作用。

2.5 新城疫病毒V蛋白 降解STAT1新城疫病毒V蛋白的干扰素拮抗机制尚不清楚，鉴于以前也被划分为腮腺炎病毒属，推测其具有类似于腮腺炎病毒属的V蛋白依赖的IFN信号逃逸机制[29]。NDV V蛋白的研究开始的比较晚，但目前的实验数据表明V蛋白也具有干扰素拮抗作用。Mebatsion等[30]利用反向遗传技术获得两株V蛋白缺失毒株，与母本毒株相比，一株缺失6 nt的RNA编辑位点，另一株不表达V蛋白C端结构域。两株重组病毒在细胞上的生长受到明显的抑制，连续传代后也不能在9-11日龄的鸡胚中生长。Huang等[31]人的研究也获得了相似的结果，V蛋白缺失株在DF1细胞上生长受到抑制，只有在Ⅰ型IFN系统缺失的Vero细胞上，缺失株的生长状况才与母本毒株相近。该研究还显示，NDV V蛋白能导致感染细胞中STAT1发生降解，故推测V蛋白可能通过引起IFN信号通路中STAT1的蛋白酶体降解从而拮抗IFN系统，其确切机制还有待进一步研究。

3 小结

副黏病毒依赖V蛋白的IFN逃避机制有所不同，但都靶向STAT蛋白。可以预见，新的副黏病毒以及它们IFN逃逸特性的发现将揭示新的STAT蛋白拮抗机制，也会揭示STAT新的功能。现有研究表明副黏病毒V蛋白可以通过与IFN信号通路中STAT蛋白的相互作用进行免疫逃逸，但是其确切机制还有待进一步研究。副黏病毒V蛋白的功能研究将会给病毒感染及肿瘤治疗提供新的思路，同时为深入研究副黏病毒与宿主细胞相互作用机制奠定良好基础。

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