β-防御素的研究进展

魏洪涛 王国珍 李 慧 李金成 (吉林大学中日联谊医院口腔科，吉林 长春 30033)

生物界中各物种对致病微生物的入侵均具有效的防御机制，这除了与后天产生的适应性免疫系统有关外，还与机体产生的抗微生物多肽和蛋白(APs)密切相关，APs包括防御素、过氧化物酶、溶菌酶、磷脂酶等多种不同分子量、不同组成的多肽和蛋白，是宿主先天性防御体系的重要组成成分〔1〕。其中防御素(defensins)是近年来颇受关注的一组抗微生物多肽。防御素具广谱抗微生物活性，能有效地杀灭病毒、细菌、真菌、螺旋体等，对肿瘤细胞也有细胞毒作用，且迄今尚未发现有致病菌株对其产生耐药性，因此人们把防御素看作是一个对付细菌耐药的突破口而对其投入了较大的关注，其中最为引人注目的是β-防御素〔2〕。

1 防御素概述

防御素最早是1980年Lehrer首次从兔肺巨噬细胞中发现的，以后在许多动物的上皮细胞、肠的Paneth细胞、中性粒细胞、及人的扁桃体〔3〕分离和检测到了防御素分子。防御素是一类富含半胱氨酸、精氨酸的阳离子抗微生物多肽，防御素分子一般由28～54个氨基酸组成，含有6～8个半胱氨酸残基，分子内有3～4个二硫键，分子量4～6 KD左右。哺乳动物的防御素分子一般含有29～42个氨基酸。防御素具有3个共同特点:小分子量(＜4 000)、带阳离子电荷、活性作用局限于细胞膜。防御素的分类和分布根据防御素的来源、分子结构特征、表达部位的不同，将防御素分为哺乳动物防御素、昆虫防御素、植物防御素，α-防御素、β-防御素等。

依据其半胱氨酸的空间位置和二硫键连接次序不同，人类防御素可分为α-防御素、β-防御素两个亚家族，是抵抗病原微生物入侵的第一道天然防线〔4〕。α-防御素含29～35个氨基酸残基，α-防御素分子链内二硫键连接位置分别为Cys1-Cys6，Cys2-Cys4，Cys3-Cys5。其中Cys1-Cys6连接N端和 C端，形成分子大环。目前其家族已有6个成员:4种人类中性粒细胞防御素(HNP)1～4，是中性粒细胞中嗜苯胺蓝颗粒的主要成分，是吞噬细胞非依赖氧杀菌机制的重要组成部分;HNP-5、6分布于小肠Paneth细胞和女性生殖道上皮。

β-防御素是1991年Diamond等首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现该类短肽，后来在牛中性粒细胞中也分离出13种。1995年 Bensch等〔5〕首次从肾衰病人血液透析液中发现HBD-1，后又在胃肠道、泌尿生殖道和口腔上皮等组织检测到，呈固有性表达;2000年Harder等〔6〕从银屑病病损皮肤中发现了HBD-2、3，HBD-2也存在于呼吸道、胃肠道、口腔上皮等组织，皮肤、扁桃体是HBD-3表达的主要组织，两者是β-防御素中在转录水平上受炎症刺激物调节的成员，呈诱导性表达;HBD-4仅局限表达于几种组织如睾丸、胃窦等，细菌感染和聚丙烯酸甲酯(PMA)增强其表达而肿瘤坏死因子-α(TNF-α)则不能使其表达增加〔7〕。

2 β-防御素的分子生物学特征

2.1 分子结构 人β-防御素HBD-1、HBD-2、HBD-3及HBD-4分别为36个氨基酸、65个氨基酸、45个氨基酸和72个氨基酸的短肽，其分子中都带有较多的正电荷，空间结构分为疏水区和带电区，肽链折叠形成三束β片层结构。与α-防御素比较两者半胱氨酸残基在氨基酸列中的位置、定位以及它们的肽链折叠和二硫键模式等都完全不同。β-防御素前体由93～95个氨基酸组成，包括信号肽、原片段和成熟肽3个部分。肽链折叠形成三束β片层结构，由6个半胱氨酸残基形成三个二硫键稳定其结构，分子中均富含精氨酸;此外，其分子中还有4个保守的甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基。HBD-3的氨基酸序列与HBD-2的约有43%的同源性。HBD-4与HBD-1、HBD-2和HBD-3只有20%～25%的氨基酸同源序列。

2.2 基因结构和定位 β-防御素的基因位于人染色体8p22～23区＜1 m的范围内，有两个外显子，一个内含子。成熟的HBD-1由36个氨基酸组成，基因大小约为7.0 kb，第一外显子编码β-防御素前体的信号肽和原片段，第二外显子编码成熟肽。由于它的基因序列中没有核转录因子(NF-κB)和活化蛋白(AP-1)的作用元件，因此不被炎症因子诱导上调，而是生理性表达在上皮细胞中〔8〕。HBD-2与 HBD-1的基因位点相距500～600 bp。HBD-2基因的片段相对较小，其内含子仅为1.6 kb，两个外显子分别为81 bp和238 bp。HBD-2基因中有四个同转录因子NF-κB相结合的序列，因而推测HBD-2是转录调控因子家族NF-κB的靶基因产物。HBD-3位于HBD-2上游，二者相距13 kb。HBD-3的基因序列编码67个氨基酸组成的多肽，其中与HBD-2具有43%的同源性。HBD-4基因的两个外显子被一个约4.5 kb的内含子所分隔，第一外显子编码大部分信号肽序列，信号肽的剩余部分加原片段和成熟肽则由第二外显子所编码。HBD 1～4基因均位于8 p 22～23.2区域。

2.3 β-防御素的表达 β-防御素表达有两种方式，分别为结构性表达(constitutive expression)和诱导性表达(induced expression)。HBD-1在正常组织中持续表达，在炎症刺激下及致炎因子存在的情况下，HBD-1表达量无明显增加，故认为HBD-1为固有表达，而HBD-2、HBD-3、HBD-4能分别被细菌因子和致炎因子诱导表达。HBD-2基因表达可通过致炎因子诱导如TNF、白细胞介素(IL-1)、LPS，细菌如酵母菌、脂多糖诱导表达。β-防御素还受作用环境的盐浓度、pH值的影响。HBD-3在生理盐水中，其活性不受影响，而HBD-4当NaCl浓度从0增至25 mmol/L，抑制葡球菌TM300的能力减少4倍。防御素在高浓度盐水下抗微生物活性被抑制，可能因为抑制了带正电的防御素结合到带负电的细菌表面，影响防御素的杀菌效力的发挥。

3 β-防御素的生物活性

3.1 抗微生物活性 β-防御素具有广谱抗微生物活性，可以有效地杀灭革兰阴性、革兰阳性菌。但就人的β-防御素而言，主要杀灭革兰阴性菌，如大肠杆菌、假单胞绿脓杆菌。而对革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌的杀灭作用不强。HBD-2对革兰阴性菌，革兰阳性菌、酵母菌均有较强杀伤作用，尤其对革兰阴性菌有高效杀菌作用，在约10μg/ml浓度下就可以达到90%的杀菌效果。微克级水平的HBD-3对革兰阳性菌、革兰阴性菌及酵母菌都有强烈杀伤作用，HBD-3相对于其他防御素对盐浓度不敏感，但对多药抗药性的金黄色葡萄球菌和抗万古霉素的粪肠球菌也可在较低浓度下发挥杀伤作用。HBD-4是一种内源性盐依赖性抗微生物肽，可抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌如大肠杆菌及酿酒酵母，且与其他抗生素及溶菌酶具有协同作用。

目前的研究表明防御素的杀菌活性来源于它对细菌阴离子质脂双分子层的穿透(包括细菌的内膜和外膜)，并在细胞膜上形成直径约20 A的孔洞，使细菌内的成分释放出来，以此来杀灭细菌。由于β-防御素带正电荷，能够与带负电荷、呈阴性的细菌表面结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区(带正电荷)则与细胞膜上带负电荷的磷脂头部以及水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等则泄漏到胞外，造成物质泄漏，最终导致不可逆性的菌体死亡。

3.2 免疫活性及作用机制 β-防御素作为机体防御性物质参与天然免疫应答，不仅具有对病原体的直接杀伤作用，还具有化学趋化作用以及与其他蛋白酶(如溶菌酶)的协同作用。在感染的局部，β-防御素被大量诱导表达和释放，对病原微生物造成直接的杀伤作用发挥其趋化活性到达感染组织局部以清除入侵的病原微生物〔9〕。β-防御素就可以激活巨噬细胞、树突状细胞，从而激活获得性免疫系统，因此，β-防御素具有联系先天性免疫和获得性免疫的作用。β-防御素可能有一个或多个具有七次跨膜结构域的受体，或者是受体耦联着Gia蛋白。对脂多糖(LPS)诱导HBD-2表达进而启动机体固有免疫的信号途径进行研究，发现LPS需要一种CD14依赖途径启动人支气管上皮(HTBE)细胞使之合成和分泌HBD-2，并最终激活NF-κB，发挥其生物学作用〔10〕。由此可见，β-防御素在机体抗微生物入侵的固有性免疫和获得性免疫中均具有重要作用。除此之外，由于肾上腺类固醇激素具有免疫抑制作用，防御素作为信号分子的功能也许可以解释其在浓度很低而不能直接杀死致病微生物时产生的生物学效应。

3.3 细胞毒性作用 防御素的细胞毒性活力是不依赖氧的机制溶解靶细胞的。防御素可以损伤真核细胞，如肿瘤细胞和人的中性粒细胞。在体外，防御素可以抑制还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性。防御素的细胞毒活性部分依赖于靶细胞膜的脂质组成和在靶细胞上的代谢活性。此外，过氧化氢酶可以与HNP协同作用来诱导细胞毒活性。在急性炎症病灶中，中性粒细胞积聚在其周围，释放防御素，在杀灭微生物的同时，还非特异性地损伤了周围一些正常细胞，这种作用呈现时间和剂量依赖特性，并且可被组织中的血浆蛋白灭活。这与防御素遇到清蛋白或血清时，其抗病毒活性大大减弱的情形有些相似。人防御素无肿瘤细胞特异性，可溶解人淋巴细胞、多形核白细胞、内皮细胞以及小鼠的胸腺细胞和脾细胞，防御素参与机体的抗肿瘤免疫活动，具有抗肿瘤细胞特性〔11〕，其抗肿瘤作用主要通过抑制氧化酶的活性，与过氧化氢酶有协同作用，并部分依赖于靶细胞膜的脂质成分而实现。

4 应用前景

4.1 解决细菌耐药问题 细菌对抗生素的耐药性是当今临床医学面临的全球性难题，防御素对于病原微生物的作用机理，使病原微生物不易对其产生抗性，与其他抗微生物肽相比具有无可比拟的优势，由于防御素之间和防御素与抗生素之间存在协同作用，可以联合应用几种防御素和抗生素来取得更好的治疗效果，或者利用其诱导表达的特性，设计药物来特异地诱导靶器官的防御素表达从而达到治疗目的。因防御素对有包膜病毒(流感病毒、艾滋病病毒等)的杀伤作用，有望应用于病毒感染性疾病、尤其是AIDS这一世界性难题的防治〔12〕。

天然获取防御素的量极其有限，而防御素分子内含有3对二硫键，化学合成的多肽难以保证正确配对，影响其生物活性;通过基因工程技术生产防御素，由于该分子的抗菌活性，面临防御素引起工程菌“自杀”的难题，给基因工程表达带来了一定困难。

4.2 在抗肿瘤方面的应用 晚期肿瘤传统的治疗方法是放疗或化疗，然而无论是放疗或化疗都不可避免地会造成造血系统和消化系统的损害，对免疫系统造成进一步的打击，并且不能完全清除残存的肿瘤细胞，防御素主要通过损伤细胞骨架而对肿瘤细胞有杀伤作用，同时防御素不会对细胞及免疫系统造成损害，这无疑是人类征服肿瘤的道路上的一大福音，为肿瘤的治疗提供了新途径。

4.3 防御素在基因工程方面的应用与研究 虽然β-防御素在黏膜防御中的重要性已得到确认，但在自然条件下防御素的表达水平极低或不表达，需要经微生物、前炎症细胞因子诱导才能表达，难以通过直接分离纯化大量获得。而利用基因工程技术的方法来生产防御素是降低成本的一条有效途径，可通过基因工程手段大量生产防御素，使其能够得到广泛利用。将不同来源的蛋白质以一定的方式连接，形成一种新型、杂合蛋白质的技术即蛋白融合技术在防御素基因工程中得到了重视，将通过人工合成或蛋白酶酶切获得的几个不同来源的肽段相互连接，获得不同蛋白质之间的融合体，可获得协同效应。目前研究多致力于寻找高效的表达载体系统。抗微生物肽基因表达的研究最初是在原核表达系统中进行的，但由于抗微生物肽对细菌的杀伤作用及原核表达缺乏酰氨化功能，因此抗微生物肽基因只能以融合蛋白形式表达。近十年基因工程被用于生产小阳离子肽。E.coli因其较快的生长速度和已确定的表达体系在基因工程中常被用作宿主细胞。然而，将E.coli作为HBD-2宿主细胞尚有两个主要问题需要解决，包括HBD-2的抗革兰氏阴性细菌活性和小肽段易被蛋白水解酶降解。以上问题可通过选择低蛋白酶活性的E.coli菌株及利用选择的质粒以抑制HBD-2的抗革兰氏阴性细菌活性来克服。此外，在细胞培养过程中细胞生长和产物表达可被分成不同的阶段。

多种防御素已在不同的表达体系中得到表达。Cabral等〔13〕将豌豆防御素(rPsdl)与酿酒酵母匹配因子α(Fα1)的分泌信号序列构建能在华赤酵母属中表达的载体，分泌表达出63.0 mg/L重组防御素培养基，并且rPsdl对黑曲霉菌有活性。在对人类尖锐湿疣的研究中，利用RT-PCR的方法进行HBD-2基因克隆。融合形式是用于表达型载体构建以避免宿主细胞的毒性作用，制成表达型载体并转染至E.coli中HBD-2以融合蛋白的形式表达。这些提示可进行HBD-2转染至E.coli中克隆表达〔14〕。研究发现，一种特殊的质粒pIVEX2.4c-trxA-shBD2构成了融合蛋白(HBD-2与His-Tag和Trx-Tag相连接)的无细胞表达系统可以增强蛋白质稳定性并使其后的提纯过程更加易行〔15〕。通过优化反应条件，目标融合蛋白的重要部分综合于生物反应器中。

今后防御素基因工程的研究工作应注意以下几个方面:①提高转基因防御素的生物学活性，使其在抗微生物方面能发挥越来越多的作用;②解决基因沉默问题，并进一步提高目的基因的表达水平和遗传稳定性;③建立生物反应器，大量生产并提纯防御素蛋白，在保持防御素生物学活性的条件下提纯防御素蛋白;合成抗微生物活力更强、抗微生物范围更广的防御素，是值得深入研究的问题。

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