蜜蜂细胞培养基（西方蜜蜂膜翅目蜜蜂科）

韦恩·亨特

蜜蜂细胞培养基（西方蜜蜂膜翅目蜜蜂科）

韦恩·亨特

媒介在膜翅目昆虫细胞培养生产的研究已趋成熟，如蜜蜂（膜翅目蜜蜂科）。用蜜蜂幼体或蛹作为初始材料，并用改进的Hert-Hunter 70培养基已经培育出多种蜜蜂细胞。蜜蜂细胞培养体系可以解决阻碍屏蔽分离群落中病原菌的困境，而这些病原菌可能会引起蜂群混乱、大批死亡。从蜜蜂的幼体到早期蛹的多个生命阶段，从头部、胸部、腹部的组织均已成功建立细胞培养。悬浮，贴壁以及类似上皮单层细胞等多种类型的蜜蜂细胞已经培养出来了。WH2刚开始是为培养半翅目昆虫，如亚洲柑桔木虱、叶蝉、Homalodisca vitripennis细胞培养，后来发现它同样适用于其他很多不同种昆虫，比如蜜蜂。蜜蜂细胞培养随温度在21～23℃变化下增加9～15天的时间。在初期离体培养组织中检测到蜜蜂残翅畸形病毒，用反转录PCR检测出以色列急性麻痹病毒（IAPV），但是没有检测到克什米尔病毒（蜜蜂急性麻痹病毒）和黑蜂王台病毒。用IAPV接种佛罗里达地区的蜜蜂样本，在经历两次传代培养后仍能检测到IAPV病毒。膜翅目昆虫如蜜蜂细胞培养的研究大大促进了蜂群崩溃失调病的研究可行性。

蜜蜂；蜂群崩溃失调症（CCD）；膜翅目；叶蝉；木虱；病毒

CCD对于授粉蜜蜂是个严峻的问题。CCD研究的瓶颈之一就是缺少蜜蜂细胞培养，细胞培养体系提供了快速评估病原菌感染作用及其在蜜蜂细胞生长与生存的影响。很多行业靠生产，利用活的昆虫作为两栖和爬行宠物的食物，利用寄生物做生物防控，比如利用蜜蜂授粉获得食物和农作物的增产。然而，蜜蜂或其他膜翅目授粉昆虫中CCD现象引起巨大关注，因为养蜂业的存亡可是与国民食品安全紧紧相连的。寄生于害虫的病毒性病原菌，不仅可以杀死害虫还能传播到其他昆虫体内。出于在人工条件下的研究和商业目的，在其他昆虫群落里也已有过CCD研究。典型的病毒性感染症状包括强势群落的前蛹期羽化为成年，然而，它们大多数刚发育为成年蜂的都不能存活。在运用环境基因学方法的深入研究下，发现了一种蜜蜂感染病毒，以色列急性麻痹病毒（IAPV）。据目前报道，蜜蜂易受17种不同的病毒侵害。它们也易受数种小孢子虫侵害，其中小孢子属尤其受关注。然而，蜜蜂病原菌因缺少细胞系而很难被找出，蜜蜂细胞培养恰好给研究者们提供了针对蜜蜂病毒和真菌类感染在CCD中的作用这样一些非常棘手的难题的解决方法。蜜蜂细胞体系的进一步应用可以解决受阻困境，更好地阐明病原菌对蜜蜂CCD的影响和作用。

1.蜜蜂幼虫和蛹的细胞

利用当地生产商提供的一个封盖的育王框巢脾，用尖头医用镊子将未封盖的幼虫和封盖巢房里的蛹小心取出。这些白色幼虫都带有刚刚长出的头。初期阶段的蛹，眼睛白色，完全发育并具有棕褐色眼睛的头部，他们选择了那些眼睛为深褐色的蛹。在消毒过的,层流净化罩中,用70%乙醇对蜜蜂体表消毒，轻轻震荡10分钟。每2分钟用0.22 μm膜过滤的水进行清洗。用无菌镊子分开其头部，胸部，腹部。在室内温度为22℃下，蜜蜂组织在WH2培养基中切分并分至24孔板，每个孔内少放组织为宜，腹部组织被分散至四个分开的平板。一般在4～10天时间，细胞呈现持续生长，接下来每隔7～12天更换一下1/3的培养基。悬浮的细胞和残骸被转移至25 cm2的组织培养瓶中，观察新细胞48小时内生长情况。

2.培养基和添加剂

蜜蜂细胞培养基WH2的组成是由木虱细胞培养基HH-70稍作修改而成。昆虫培养基代替培养基199。在WH2培养基中24小时内可以看到接种的组织贴壁生长，L-谷氨酸的添加与否不影响细胞的生长，因此实验最后没添加L-谷氨酸。L-glutamine WH2培养基的成份见表1。庆大霉素被用作抗生素。针对含有个别培养基配置而成的商业化的可用培养基的筛选，每隔8天对细胞的贴壁生长情况进行观察。加有10%胎牛血清的培养基之后，分别检测蜜蜂细胞在HH-70木虱细胞培养基生长情况，再观测和在Sf-900TMIII SFM中无10%胎牛血清的培养基的蜜蜂细胞的生长情况。试验显示，细胞生长缓慢，呈半透明，通常观察到的是以单个细胞形式存在。细胞在Ex-Cell 405能存活，但细胞贴壁和生长速率极慢，处于一个非常低的频率。将HH-70中其他的成分作为细胞培养基，蜜蜂细胞可以存活，但没有贴壁生长。

3 .细胞系检测

通过PCR，利用蜜蜂特异性引物与肌动蛋白进行分析。从细胞培养和成年蜂中提取其染色体DNA，提取方法：AquaPureRGenomic DNA Kits(BIO-RAD,Hercules,CA)。PCR试验是用PlatinumRPCR Super-MixTM，反应条件是：95℃，3分钟；95°C，30秒，60℃，30秒；72℃，30秒，30个循环；最后72℃下维持5分钟，从而得到提取物。叶蝉基因作为阴性对照。结果显示，细胞培养和成年蜂中的肌动蛋白基因中扩增引物的大小和序列是相同的，但与木虱中的不同。

与Maori等.2009年的报道相类似，在培养体中，发现只有残翅病毒被检测到。接种过IAPV的细胞在数次继代培养后检测仍呈阳性。在WH2培养基中培养蜜蜂幼虫和蛹的细胞，24小时就能观察到细胞贴壁蔓延生长。单层细胞是由类似叶蝉的两种上皮细胞组成。细胞培养基都贴上“AmWH”标签。这种梭状的细胞，1～2 μm宽，2.5～10 μm长，形成细胞簇。悬浮培养出的是圆形细胞，直径为1～2 μm。尽管以前培养基评估中有2 mM L-谷氨酸，然而此评估显示L-谷氨酸的有无对细胞生长没有影响，但是来自草地夜蛾的鳞翅类细胞系在谷氨酸盐缺乏的培养基上不能生长。

如今，拥有可以提供蜜蜂细胞生长的培养基，为研究者提供了极需的研究工具，而它将在围绕引起膜翅目授粉昆虫的CCD原因和针对CCD获得可行性的解决办法具有重要意义。蜜蜂细胞培养同样提供了一个在蜜蜂繁殖中病毒感染的高度防控体系，对其在蜜蜂病毒病理学上的进一步研究具有重要意义。

注：蜜蜂细胞培养基WH2成分

Schneider's Insect Medium 150 ml

0.06 ML-histidine solution(pH 6.35)200 ml

Fetal Bovine Serum(heat inactivated)a 50 ml

CMRL 1066 15 ml

Hanks'Salts 5 ml

Insect medium supplement(×10)2 ml

Gentamicin,units/1 μl/ml

培养基总容量422 ml；用HCl和NaOH调节pH在6.3～6.5范围中

56°C胎牛血清热处理30分钟

安徽农业大学蜜蜂研究所 汪天澍 余林生译