神经轴突牵拉后的生物学变化及相关机制的研究进展

侯红平，张立海，张里程，蓝 霞，刘道宏，熊 琦，唐佩福

1中国人民解放军总医院骨科，北京100853

2南开大学医学院，天津300071

在组织胚胎发育过程中，神经元胞体与其靶细胞或靶器官在相对较短的距离内建立轴突联系后，生长锥、化学因子趋化作用和物理引导作用随即消失［1-2］。随着动物躯体的增长，胞体与其靶细胞或器官之间的轴突联系也随之增长，而此时轴突延长的唯一可能解释就是机械牵引力的牵拉［3-5］。机械力牵拉引起的轴突增长速度远远超过轴突内物质运输或轴突出芽再生的速度。以蓝鲸为例，其生长速度可以达到每天3 cm左右，轴突的牵拉延长也需与身体的生长速度相一致，而慢速轴浆运输每天却只能达到几毫米［6-7］。在临床病例，尤其是骨科患者中，存在众多神经轴突牵拉损伤的案列，包括地震、车祸、撞击等固定姿势过度牵拉某一部位的神经造成的牵拉伤，重则损伤神经无法行使正常功能，轻则神经及其支配的肌肉经常性的神经痛，对患者造成不同程度的心理和身体的伤害，因此对轴突牵拉后的生物学变化及其相关机制的研究已成为解决临床牵拉伤的迫切需要。在相关动物和细胞实验研究中，轴突牵拉模型有很多种，主要包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物膜牵拉轴突、球囊吸附牵拉、体外神经牵延器、固定体位神经牵拉等。本文主要从形态学观察、细胞膜、细胞骨架、细胞代谢和动作电位等方面对近几年有关轴突牵拉的相关研究进行综述。

轴突牵拉后的形态学变化

机械力牵拉后，轴突为适应这一变化，在方向、直径和表面形态等方面也存在相应的变化。

首先，轴突的方向。体外培养的神经元建立的轴突联系的方向是杂乱无章的，但有研究显示轴突牵拉后，原本随机分布的轴突与周围的小束发生连接，逐渐联合成较大的束，其方向逐渐取得一致［8］。这也提示机械力在轴突方向的可塑性上发挥重要的作用。这一发现也被科研学者应用到了神经损伤修复的移植方面［9］。众所周知，神经损伤后移植神经的来源存在较大的争议，但培养的神经元经牵拉后，其生长长度和方向为移植神经提供了可靠的通道和来源。因此经牵拉后的神经将成为修复神经的重要来源。

其次，轴突的直径。轴突在机械力作用后，其粗细必然会发生改变。Pfister等［2］研究显示，轴突的平均直径在牵拉后非但没有变细，反而增粗了约30%。另有研究显示，轴突的直径在牵拉后先变细后增粗［10-11］。笔者认为，之所以出现这种差异，在于不同的课题组采用的牵拉体系有所不同，另外轴突牵拉后观察时间点的不同对观察结果也有较大影响。因此，轴突牵拉后的直径变化需要更统一的模型，更确切、更实时的观察手段去验证。但是，不管轴突的直径如何变化，其中的生化机制和相关蛋白的合成却是值得考虑的，轴突牵拉后如何能够在短时间内合成所需的蛋白来满足需要，这也将是今后研究的重中之重。

最后，表面形态方面。Smith等［12］和 Kilinc等［13］在轴突牵拉后发现了一种称为“延迟弹性”的现象，原本弯曲呈波浪状的轴突在牵拉过程中方向笔直，而牵拉完成后又会恢复为原始状态，他将此现象归咎于轴突形状的分子记忆，但尚缺少明确的证据［2，6，8］。这是否是轴突的一种自我修复或保护机制，尚有待于进一步的研究。另外，有学者在不同的牵拉体系均发现轴突牵拉后其表面出现了不同大小的“隆起物”，经过激光共聚焦染色发现，细胞骨架神经丝在此聚集［13］。细胞骨架聚集于此的机制到目前尚未得到阐明，需做进一步的研究与探讨。笔者分析可能与物质运输速率的增快密切相关。

轴突牵拉后形态上发生的变化，对其深入研究的探讨将会进一步揭示轴突生理性牵拉和病理性牵拉的区别，从而更好地运用牵拉后的神经，解决病理性牵拉所引起的功能障碍。

轴突牵拉后的细胞膜变化

细胞膜不仅为细胞的正常生命活动提供稳定的内环境，其完整性和功能的正常性对物质运输、信息传递和各种酶的活性有重要的意义。因此，轴突牵拉后对其细胞膜的研究显得尤为重要。目前研究主要集中在对细胞膜完整性和通透性的研究。普遍认为，轴突牵拉后，细胞膜出现不同程度的损伤，与牵拉强度和牵拉时间密切相关。

细胞膜通透性的变化 辣根过氧化物酶是检测细胞膜通透性的常用物质，原本不能进入细胞内的辣根过氧化物酶在牵拉后出现不同程度的可通透性，牵拉强度越大，其通透的能力越强，生物膜的损伤程度越大［14-16］。有学者分析指出，细胞膜上出现了一定大小的孔，从而使不能进入细胞的物质通过孔道进入细胞［13，17］。在以荧光分子作为染料标记细胞的研究中，细胞膜呈现不通透、通透、通透性减弱的发展趋势［18-19］，表明细胞膜在牵拉后出现一定的损伤，但同时细胞膜具有一定的自我修复能力。这可能与细胞膜通透性改变、Ca2+透过细胞膜、启动细胞内一定的信号通路或修复机制引起细胞膜的自我修复相关。但其中具体的修复途径仍需进一步的研究。

利用不同相对分子质量和直径的荧光分子，可以判定出细胞膜牵拉后出现的孔的大小，但这也只是粗略的估计，是否出现孔，孔的直径有多大尚需要结合一定的研究手段做出分析。另外，表面活性剂能够限制细胞内分子的不可控制的释放，可作为修复细胞膜通透性的研究物质，从而保护细胞膜免受氧化损伤和代谢失衡的影响。通过对牵拉细胞轴突的生物膜的通透性的研究，有望将来发展成为新型的过滤生物膜，可应用在污染水的生物过滤等方面。利用不同孔径的生物膜可实现生物的精细分类。

细胞膜上离子通道的变化 细胞膜上存在一定的离子通道，如K+、Na+、Ca2+通道，细胞膜通透性的改变对其上的离子通道的通透性有一定的影响。有研究表明，轴突牵拉后，K+、Na+的敏感性和活性均未发生改变，但其密度却出现了增加的现象［20］。在胞体中，K+、Na+通道的密度均出现了增高的趋势;而在轴突中，Na+的密度增加，而K+的密度却未发生变化［8，21］。对这种差异性的出现目前尚未做出合理的解释。另外，轴突牵拉后发现了Na+和Ca2+的内流［22］。Na+内流的可能机制有以下3种:(1)Na+通道的通透性增强引起Na+的内流;(2)Na+-K+酶的活性降低引起Na+的内流，这可能与线粒体的损伤有关;(3)Na+泵的损伤造成Na+的内流，与能量供应不足相关。Serbest等［23］提出 Ca2+内流的3种相关机制:(1)轴突牵拉后，引起Na+通道的开放，Ca2+通过Na+通道进入细胞内，引起Ca2+的内流;(2)轴突牵拉后，不正常Na+的内流引起Na+-Ca2+交换体的逆转。Na+-Ca2+交换体是利用Na+的内流引起Ca2+排出细胞外，但逆转后却引起Ca2+的内流;(3)轴突牵拉Na+内流引起细胞去极化，从而激活Ca2+依赖的电压门控通道引起Ca2+的内流。但究竟是哪种机制引起Na+和Ca2+的内流，或者几种机制相互作用，仍需做进一步的验证和解释。轴突牵拉后生物膜的变化，尚有许多问题有待解决，例如轴突是否存在传导机械力的通道和分子，这些外界的力量是如何传到轴突的双层磷脂膜上的，损伤的细胞中轴突在什么样的微环境中可以得到自我修复的能力等。在今后的研究中，将着重探讨轴突生物膜的通透性变化的最大程度，以及轴突自我保护和修复机制。

轴突牵拉后的细胞骨架变化

在真核细胞中，细胞骨架是保持细胞形态和细胞运动有关的纤维网络，包括微丝、微管和中间丝。在神经元中，微丝由肌动蛋白组成，微管由微管蛋白组成，中间丝由神经丝组成。轴突牵拉后，细胞骨架的结构发生了相应的改变。

肌动蛋白 肌动蛋白是微丝的结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体。单体肌动蛋白是由一条多肽链构成的球形分子，又称球状肌动蛋白;肌动蛋白多聚体形成肌动蛋白丝，称为纤维状肌动蛋白。有关轴突生长锥的研究中，肌动蛋白处于生长锥的前端，通过其前端的解聚和后端的再聚合对生长锥的生长提供一定的方向［24］。但在生长锥消失后以及建立突触联系的轴突在牵拉后的肌动蛋白的相关情况鲜有报道。

微管蛋白 微管蛋白是球形分子，有两种类型:α微管蛋白和β微管蛋白，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。Tang-Schomer等［9］研究显示，在轴突牵拉完成后，用Taxol处理细胞发现细胞在180 min后逐渐恢复正常状态，而在40 min后若将Taxol洗去，细胞的恢复时间和恢复程度远低于用Taxol处理的细胞，若用Nocodazole处理细胞，发现细胞在40 min后发生断裂，提示神经轴突在牵拉完成后，存在一定的损伤，这种损伤可以通过自身修复，而微管蛋白在这种修复的过程中发挥一定的作用。另外，微管蛋白作为细胞快速轴浆运输的构成成分，在轴突牵拉后的密度有所下降［13］，可能与钙离子内流聚集浓度升高引起微管蛋白的解聚有关。

神经丝 神经丝是存在于神经细胞轴突中的一种特化的中间丝，除有支持作用外，还与物质运输有关。Chung等［25］应用激光共聚焦定位发现，轴突牵拉后神经丝集中在轴突的“隆起物”中，提示神经丝在此聚集，作为内源性因子可能触发轴突运输的破坏从而引起轴突直径的增粗。另外，Hoffman等［26］还发现轴突牵拉后，出现了神经丝环状结构，并且随着牵拉强度的增大有增多的趋势，环状结构的出现可能与轴突的自我保护有关。另有研究显示，神经丝与神经丝之间的距离下降［25］。神经丝除了主干外，在主干周围还存在类似于侧臂的结构，这种侧臂有3种亚型，神经丝-重链、神经丝-轻链、神经丝-中间链。而侧臂之间主要由蛋白质的-COOH组成，-COOH通常被磷酸化，从而通过负电荷的相互排斥引起侧臂向各个方向的延伸，引起神经丝构成支持轴突的骨架。有报道，轴突牵拉后，这种神经丝间的距离下降从而引起神经丝的聚集［14］。笔者分析可能由于轴突牵拉引起钙离子的内流，激活钙激活中性蛋白酶，从而抑制神经丝侧臂-COOH的去磷酸，失去负电荷之间的排斥力，从而降低神经丝之间的距离，引起神经丝的聚集。

机械力作用后，神经元与轴突的细胞骨架均出现了不同程度的变化，细胞骨架结构的变化、密度的增加或减少以及之间的相互作用，均引起胞浆的物质运输、轴突的形态功能的变化。细胞骨架在牵拉后改变的机制和修复，将成为今后研究的重点。

轴突牵拉后的细胞代谢

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)Staal等［27］研究显示轴突牵拉后，UPS和神经丝所在的位置发生重叠，都出现在“隆起物”中，提示UPS在此聚集。利用蛋白酶体抑制剂和乳胞素分别处理细胞，而细胞的继发性轴突变性加剧。蛋白酶体抑制剂和乳胞素能够抑制UPS的活性，提示UPS聚集在“隆起物”中，可能引起细胞骨架的重新排列，起到保护神经元的功能。

乳酸脱氢酶的释放 乳酸脱氢酶的释放可以作为细胞损伤的生化标记物，Ellis等［28］和 Geddes等［29］在对星形胶质细胞的牵拉研究中发现存在乳酸脱氢酶的释放，并且随着牵拉程度的增强，释放量有增强的趋势。提示在牵拉后星形胶质细胞出现了不同程度的破坏。轴突牵拉后乳酸脱氢酶是否存在释放的现象、释放的时间以及相关强度如何均需要进一步的实验验证。

糖原的积累 Maxwell等［30］研究显示轴突牵拉后引起糖原的积累，推测可能由于钙离子的内流刺激糖原的合成，引起糖原的积累，为轴突运输提供一定的能量，减轻轴突运输破坏引起损伤的压力。但糖原如何在短时间内大量积累、细胞和轴突内是否存在其他代偿机制，均需进一步的研究与探讨。

轴突牵拉后的动作电位变化

正常的动作电位有Na+的内流引起细胞的去极化，构成动作电位的上升峰，而K+的外流引起细胞的复极化，构成动作电位的下降峰。研究显示在轴突牵拉后，随着牵拉程度的不断增大，细胞的动作电位有3个阶段不同的损伤［31-32］。(1)电位传导的部分损失，但这种损失是可逆的，提示可能是由于短暂的离子流的紊乱引起的。(2)可能复合动作电位的振幅增加，但可通过加入4-四氨基吡啶恢复，提示可能是由于髓鞘损伤引起的。(3)即使用4-四氨基吡啶处理也不可逆的动作电位损伤，可能由于解剖学上的膜损伤引起的。

综上，利用机械力作用于神经元，可引起神经元和轴突相应的生理生化的改变，但神经元如何通过这些改变来适应机械力、维持自身正常功能并未得到圆满解决，未来需要更统一的牵拉模型、更确切的观察方法、更实时的技术手段来实现对轴突牵拉后胞体和轴突改变的研究。通过对这一方面的基础研究，明确生理性牵拉和病理性牵拉的临界点。在生理性范围内牵拉的轴突，可作为治疗周围神经损伤的支架，通过修复病理性牵拉的轴突，可改善损伤后功能的恢复，这将为临床各种损伤或疾病的正确处理和治疗提供一定的研究价值。

［1］Kameswaran N，Cullen DK，Pfister BJ，et al.A novel neuroprosthetic interface with the peripheral nervous system using artificially engineered axonal tracts ［J］.Neurol Res，2008，30(10):1063-1067.

［2］Pfister BJ，Iwata A，Meaney DF，et al.Extreme stretch growth of integrated axons ［J］.J Neurosci，2004，24(36):7978-7983.

［3］Pfister BJ，Iwata A，Taylor AG，et al.Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons［J］.J Neurosci Methods，2006，153(1):95-103.

［4］Geddes DM，Laplaca MC，Cargill RN.Susceptibility of hippocampal neurons to mechanically induced injury ［J］.Exp Neurol，2003，184(1):420-427.

［5］Shi R.The dynamics of axolemmal disruption in guinea pig spinal cord following compression ［J］.J Neurocytol，2004，33(2):203-211.

［6］Smith DH，Wolf JA，Meaney DF.A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons:continuous mechanical tension ［J］.Tissue Eng，2001，7(2):131-139.

［7］Owens J.Neurons go to great lengths for new therapy ［J］.Drug Discov Today，2001，6(12):600-601.

［8］Smith DH.Stretch growth of integrated axon tracts:extremes and exploitations［J］.Prog Neurobiol，2009，89(3):231-239.

［9］Tang-Schomer MD，Patel AR，Baas PW，et al.Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity，microtubule disassembly，and axon degeneration ［J］.FASEB J，2010，24(5):1401-1410.

［10］Barbee KA.Mechanical cell injury ［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1066:67-84.

［11］Laplaca MC，Prado GR.Neural mechanobiology and neuronal vulnerability to traumatic loading ［J］.J Biomech，2010，43(1):71-78.

［12］Smith DH，Wolf JA，Lusardi TA，et al.High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury ［J］.J Neurosci，1999，19(11):4263-4269.

［13］Kilinc D，Gallo G，Barbee KA.Mechanically-induced mem-brane poration causes axonal beading and localized cytoskeletal damage ［J］.Exp Neurol，2008，212(2):422-430.

［14］Pettus EH，Povlishock JT.Characterization of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability ［J］.Brain Res，1996，722(1-2):1-11.

［15］Shi R，Whitebone J.Conduction deficits and membrane disruption of spinal cord axons as a function of magnitude and rate of strain ［J］.J Neurophysiol，2006，95(6):3384-3390.

［16］Galle B，Ouyang H，Shi R，et al.Correlations between tissue-level stresses and strains and cellular damage within the guinea pig spinal cord white matter［J］.J Biomech，2007，40(13):3029-3033.

［17］Geddes DM，Cargill RN，Laplaca MC.Mechanical stretch to neurons results in a strain rate and magnitude-dependent increase in plasma membrane permeability ［J］.J Neurotrauma，2003，20(10):1039-1049.

［18］Shi R，Pryor JD.Pathological changes of isolated spinal cord axons in response to mechanical stretch ［J］.Neuroscience，2002，110(4):765-777.

［19］Hallow DM，Seeger RA，Kamaev PP，et al.Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics ［J］.Biotechnol Bioeng，2008，99(4):846-854.

［20］Iwata A，Browne KD，Pfister BJ，et al.Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions ［J］.Tissue Eng，2006，12(1):101-110.

［21］Pfister BJ，Bonislawski DP，Smith DH，et al.Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals［J］.FEBS Lett，2006，580(14):3525-3531.

［22］Wolf JA，Stys PK，Lusardi T，et al.Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels ［J］.J Neurosci，2001，21(6):1923-1930.

［23］Serbest G，Burkhardt MF，Siman R，et al.Temporal profiles of cytoskeletal protein loss following traumatic axonal injury in mice ［J］.Neurochem Res，2007，32(12):2006-2014.

［24］Bueno FR，Shah SB.Implications of tensile loading for the tissue engineering of nerves ［J］.Tissue Eng Part B Rev，2008，14(3):219-233.

［25］Chung RS，Staal JA，Mccormack GH，et al.Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy ［J］.J Neurotrauma，2005，22(10):1081-1091.

［26］Hoffman PN，Griffin JW，Price DL.Control of axonal caliber by neurofilament transport［J］.J Cell Biol，1984，99(2):705-714.

［27］Staal JA，Dickson TC，Chung RS，et al.Disruption of the ubiquitin proteasome system following axonal stretch injury accelerates progression to secondary axotomy ［J］.J Neurotrauma，2009，26(5):781-788.

［28］Ellis EF，Mckinney JS，Willoughby KA，et al.A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture:characterization of the model using astrocytes ［J］.J Neurotrauma，1995，12(3):325-339.

［29］Geddes DM，Laplaca MC，Cargill RN.Susceptibility of hippocampal neurons to mechanically induced injury ［J］.Exp Neurol，2003，184(1):420-427.

［30］Maxwell WL，Irvine A，Strang RH，et al.Glycogen accumulation in axons after stretch injury ［J］.J Neurocytol，1990，19(2):235-241.

［31］Shi R，Borgens RB.Acute repair of crushed guinea pig spinal cord by polyethylene glycol［J］.J Neurophysiol，1999，81(5):2406-2414.

［32］Shi R，Whitebone J.Conduction deficits and membrane disruption of spinal cord axons as a function of magnitude and rate of strain ［J］.J Neurophysiol，2006，95(6):3384-3390.