二甲双胍调节内皮细胞组织因子途径抑制物的表达

侯英健，史小琴，韩艳梅，李 惠，郭昊天

(河北大学基础医学院，河北保定 071000)

组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)高表达于血管内皮细胞表面，特异性抑制外源性凝血途径，是一种控制凝血启动的抗凝蛋白［1］。血栓形成是糖尿病的主要并发症之一。糖尿病患者血糖持续升高，导致糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的生成［2］。AGEs水平可上调组织因子，促进血栓形成。作为控制糖尿病的一线用药，二甲双胍明显缓解糖尿病并发症［3］，但目前尚无其调节糖尿病血栓及TFPI表达的报道。本研究检测了二甲双胍对TFPI表达的影响，并初步探讨了其中机制，为糖尿病血栓的干预提供了新的靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂 二甲双胍(美国Sigma公司)，兔抗人 β-actin多克隆抗体及小鼠抗人TFPI单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养 从人脐静脉中分离原代内皮细胞，种植于铺有鼠尾胶原的培养皿中，用含10% 胎牛血清的M199培养基常规培养。

1.2.2 糖基化牛血清白蛋白的制备 将牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖溶磷酸缓冲液中(pH 7.4)，过滤除菌后在37℃下孵育3个月。

1.2.3 荧光实时定量PCR检测TFPI mRNA的表达 提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。用MxPro QPCR系统进行定量PCR检测。β-actin作为内参照。

1.2.4 Western blot方法检测蛋白表达 提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后，加入适当浓度的第一抗体(室温孵育4 h)和第二抗体(室温孵育1 h)后，进行化学发光(ECL)显色。

2 结果

2.1 二甲双胍上调内皮细胞TFPI mRNA水平 AGEs(50 mg·L-1)明显下调内皮细胞TFPI mRNA表达(P＜0.01)。在AGEs刺激内皮细胞的同时，给予二甲双胍。结果表明，1 μmol·L-1的二甲双胍对TFPI的表达无明显调节作用，而5与10 μmol·L-1的二甲双胍均明显逆转AGEs对TFPI的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 二甲双胍上调内皮细胞TFPI蛋白表达水平 AGEs(50 mg·L-1)明显下调内皮细胞TFPI蛋白表达，而二甲双胍(5 μmol·L-1)明显逆转AGEs对TFPI的抑制作用。

3 讨论

二甲双胍不仅能够有效控制血糖，还明显抑制糖尿病血管并发症。王景尚等［4］研究表明，其机制可能为二甲双胍降低了血浆中 AGEs的水平。但是本课题组发现，即使在AGEs含量不发生改变时，二甲双胍仍能够通过调节其下游通路发挥抗凝作用。我们以AGEs刺激血管内皮细胞，同时给予二甲双胍处理。检测后发现，二甲双胍部分阻断了AGEs对TFPI表达的抑制作用。本课题组之前研究表明，AMPK上调TFPI表达，进而发挥抗血栓的作用［5］，而二甲双胍激活AMPK的作用已得到广泛证实。因此我们推断AMPK信号通路参与了二甲双胍对TFPI的上调作用。

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